Свідоцтво №30-08 від 04.03.2008
ФР.1.31.2008.01033

1. Об'єкти дослідження

Дана методика виконання вимірювань поширюється на копчені м'ясні, копчені рибні та жирові продукти та встановлює визначення масової концентрації бенз(а)пірена методом високоефективної рідинної хроматографії з флуориметричним детектуванням.

2. Діапазон вимірів

ГДК бенз(а)пірена у жирових, копчених м'ясних, копчених рибних продуктах становить 1 мкг/кг.

Метод забезпечує отримання результатів вимірювань масової концентрації бенз(а)пірена у діапазонах, представлених у таблиці 1.

Таблиця 1. Діапазони вимірювання масової концентрації бенз(а)пірена

Вид продукції	Діапазон масовий концентрації, мкг/кг	ГДК, мкг/кг
жирові продукти	0,5 – 2,0	1,0
копчені м'ясні продукти	0,5 – 2,0	1,0
копчені рибні продукти	0,5 – 2,0	1,0

3. Пробопідготовка

Відбір, консервація та зберігання проб продукції проводиться відповідно до ГОСТ 7631, ГОСТ 9792, ТУ та іншої нормативної документації, що регламентує відбір проб для конкретних видів продукції.

Пробопідготовка складається з етапів відбору проби (пробу попередньо охолоджують при температурі мінус 12-18 ° С протягом 30 хв), подрібнення, гомогенізації з сірчанокислим натрієм безводним, екстракції гомогенізованої проби гексаном в колбі з використанням УЗ-ванни, мимовільного осадження перебігу 1-2 хв), знежирення екстракту в морозильній камері (в циліндр вносять навішування силікагелю, доливають екстракт, вміст циліндра поміщають в морозильну камеру), очищення надосадкового гексанового шару методом неутримуючої твердофазної екстракції (на картриджах Strata) елюату в струмі повітря або інертного газу.

* Примітка. При концентрації жирів вихідного аналізованого продукту менше 5% до вихідного екстракту проби після виморожування необхідно додати невелику кількість елююючого реагенту - етилацетату (0,1 мл до 6 мл очищеного екстракту).

4. Проведення хроматографічного аналізу

4.1. Обладнання та умови для проведення ВЕРХ-аналізу градуювальних розчинів бенз(а)пірена, підготовленої проби продукту.

Для хроматографічного аналізу бенз(а)пірена необхідно використовувати високоефективну ізократичну рідинну хроматографічну систему з флуориметричним детектуванням.

Для проведення аналізу попередньо готують градуювальні розчини з ДСО розчину бенз(а)пірена в гексані або з ДСО розчину бенз(а)пірена в ацетонітрилі (розчинник віддмухують, перерозчиняють стандартний зразок в гексані); проводять пробопідготовку; готують до роботи прилад.

Обладнання:

хроматограф рідинний "Стаєр" з флуориметричним детектором;

персональний комп'ютер із встановленим програмним забезпеченням "МультиХром для Windows XP" версії 1.5 або 2х.

ізократичний режим;

колонка: Luna С18 (2) 150х3, 0 мм 3 мкм (Phenomenex, США);

захисна колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);

рухома фаза: розчин ацетонітрил/вода (75:25);

швидкість потоку: 0,3 мл/хв;

об'єм петлі: 10 мкл;

температура: 50 ° С;

діапазон RFU: 0,01;

детектування: флуориметричне (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуювання проводять по градуювальним розчинам (у всьому діапазоні визначених концентрацій) не рідше 1 разу на два тижні, а також при використанні нової партії реактивів, заміні колонок та після ремонту хроматографа.

4.2. Визначення кількісного вмісту бенз(а)пірену в пробі продукту.

Для визначення кількісного вмісту компонента проби продукту (бенз(а)пірена) проводять хроматографічний аналіз одного з градуювальних розчинів і далі хроматографічний аналіз підготовленої проби. Для достовірності вимірювань хроматографічний аналіз як градуювального розчину, і підготовленої проби проводять щонайменше 2 разів поспіль.

Використовуючи встановлене програмне забезпечення – «МультиХром для Windows XP» у звіті або над піком (залежно від установок опцій «ВИД») після закінчення вимірювання автоматично визначається результат у вигляді концентрації в пробі, введеній у хроматограф (але не у вихідному зразку, взятому для дослідження!).

Для отримання результату необхідно провести як мінімум два паралельні виміри (отримати дві хроматограми). За результат вимірювань приймають середнє арифметичне значення вмісту бенз(а)пірена в концентраті аналізованої проби C хр, мкг/л (розраховується з двох значень масової концентрації бенз(а)пірена в концентраті аналізованої проби 1 і 2).
Масову частку бенз(а)пірена в аналізованій пробі (у вихідному зразку) Хмкг/кг розраховують за формулою:

де:
З хр – середнє значення концентрації бенз(а)пірена, отримане в результаті хроматографування у двох паралельних вимірах [нг/мл];
V 1 - Обсяг вихідного екстракту, фактично рівний обсягу гексану, взятого для первинної екстракції (50 мл);
V 2 - Об'єм екстракту (частина вихідного), взятого на виморожування (30 мл);
V 3 - обсяг екстракту (частина екстракту після виморожування), взятого для проведення ТФЕ (6 мл) [мл];
V 5 - обсяг кінцевого екстракту, частина з якого вводиться в хроматограф (близько 3 мл) [мл];
До пробовідбору - Коефіцієнт пробовідбору, що враховує частку маси проби продукту (в суміші з сульфатом натрію) взятого для екстракції, від загальної маси проби, взятої на аналіз. У всіх випадках дорівнює 0736;
K виморожування - Коефіцієнт втрат бенз(а)пірена при виморожуванні. Для всіх категорій досліджуваних товарів цей коефіцієнт однаковий і дорівнює 0.95;
K екстр.1 - Коефіцієнт первинної рідинної екстракції гексаном. Для всіх категорій досліджуваних товарів однаковий і дорівнює 0.95;
K ТФЕекстр.2- Коефіцієнт твердофазної екстракції бенз(а)пірена, дорівнює 0,95;
m ін. – ґрунту або ґрунту, взятого на аналіз [г].

стор 1

стор 2

стор 3

стор 4

стор 5

стор 6

стор 7

стор 8

стор 9

стор 10

стор 11

стор 12

стор 13

стор 14

стор 15

стор 16

стор 17

стор 18

стор 19

ГОСТ 24104.

Випарник ротаційний ІР-1М.

ГОСТ 25336.

Лазня водяна.

Мішалка магнітна типу ММ-ЗМ із електропідігрівом.

Освітлювач ультрафіолетовий типу «Хроматоскоп» зі спектральним діапазоном 250 - 700 нм та лампою типу БУВ-15 як джерело УФ-випромінювання.

Камера хроматографічна скляна 40 х 40 х 40 см.

Пластинки скляні для тонкошарової хроматографії 5 х 20 та 20 х 20 см.

Колонка скляна хроматографічна довжиною 500 мм та діаметром 20 мм з відтягнутим унизу кінцем та резервуаром місткістю 50 - 60 см 3 ПШ 14/23.

Холодильник ХПТ-2-400-29/32 ХС або ХШ-1-400-29/32 ХС за ГОСТ 25336 .

Алонж типу АІО-14/23-50 ТС або АІО-14/23-14/23-65 ТС за ГОСТ 25336.

Лінійка вимірювальна з ціною поділу 0,1 см за ГОСТ 427.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТЗ або 300-19/26-29/32 за ГОСТ 25336.

Насадка П-1-19/26-14/23-14/23 ТС або Н-2-19/26-14/23 ТС за ГОСТ 25336.

ГОСТ 25336.

ГОСТ 25336. Циліндри мірні 1-100, 1-250 або 3-100, 3-250 за ГОСТ 25336 .

Склянка хімічна В-1-100 або В-1-150 за ГОСТ 25336 .

Колби К-1-100-29/32 ТХС, К-1-25Р-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС або П-1-500-29/32 ТХС за ГОСТ 25336 .

Вирва Бюхнера 1 або 2, або 3 за ГОСТ 9147 .

Стаканчики для зважування (бюкси) СВ-14/8 або СВ-19/9 або СВ-24/10 або СВ-34/12 за ГОСТ 25336 .

Мікрошприци типів МШ-10, скляні капіляри.

Папір індикаторний універсальний.

Папір фільтрувальний лабораторний за ГОСТ 12026 .

Скальпель чи тонкий шпатель.

Спирт етиловий ректифікований за ГОСТ Р 51652 або спирт етиловий технічний ректифікований за ГОСТ 18300 .

Ацетонітрил за нормативним документом.

Целюлоза мікрокристалічна порошкова за нормативним документом.

ГОСТ Р 51650-2000

Бенз(в)хризен, вміст основної речовини не менше 98%.

Сефадекс LH-20

Силікагель марки АСКГ за нормативним документом.

Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками та обладнання з технічними характеристиками, а також реактивів та матеріалів за якістю, не нижчою від вищевказаних.

5.2 Підготовка до випробування

5.2.1 Підготовка розчинників

Розчинники (н.гексан, етиловий спирт, ацетон, бензол) переганяють у загальноприйнятий спосіб з дефлегматором.

Диметилформамід переганяють, додавши в перегінну колбу 120 см 3 бензолу та 36 см 3 води на 1 дм 3 розчинника.

5.2.2 Приготування ацетильованої целюлози

(50,0±2,0) г мікрокристалічної целюлози поміщають в плоскодонну колбу місткістю 500 см 3 додають приготовану в окремій колбі суміш 150 см 3 бензолу або толуолу, 70 см 3 оцтового ангідриду і 0,3 см 3 сірчаної кислоти. Реакційну суміш перемішують магнітною мішалкою протягом 6 - 8 год, залишають без перемішування ще на 18 год, після чого декантують рідку фазу, а залишок заливають 300 см 3 етилового спирту, перемішують, залишають у спирті на 24 год, потім целюлозу відфільтровують , промивають 100 см 3 етилового спирту та дистильованою водою до нейтральної реакції промивних вод (по індикаторному папері).

Потім перевіряють хроматографічну активність ацетильованої целюлози. Для цього за 3 - 4 години до проведення аналізу готують суміш етилового спирту, ацетону і води, взятих в об'ємному відношенні 60:25:15, і виливають її у вистелену смужками фільтрувального паперу хроматографічну камеру. Висота шару розчинника повинна становити 1,5 - 2 см. 1,5г ацетильованої целюлози суспензують в 7 см 3 етилового спирту і виливають суспензію рівним шаром на скляну пластину 5 х 20 см, дають розчиннику повністю випаруватися на повітрі і наносять капіляром у точку 5 мкл розчину бенз(а)пірена масової концентрації 1 мкг/см3. Пластину поміщають у хроматографічну камеру і залишають у камері до тих пір, поки рівень розчинника підніметься не менше ніж на 100 мм від лінії старту. Після закінчення хроматографії пластину виймають, висушують на повітрі і під лампою ультрафіолетового опромінювача відзначають флуоресцирующее блакитним кольором пляма бенз(а)пірена. Вимірюють відстань від стартової лінії до фронту розчинника та до середини плями бенз(а)пірена; розраховують значення Rj, що оцінює швидкість переміщення бенз(а)пірена по платівці за формулою:

де Х БП - відстань від стартової лінії до середини плями бенз(а)пірена, мм;

L – відстань від стартової лінії до фронту розчинника, мм.

Значення Rj бенз(а)пірена має становити 0,1.

Для приготування робочої пластини 5 г ацетильованої целюлози суспензують 20 см 3 етилового спирту і виливають рівним шаром на пластину 20x20 см.

5.2.3 Приготування стандартних розчинів бенз(а)пірена та бенз(в)хризену

У стаканчики для зважування (бюкси) відважують по (10,0+0,2) мг бенз(а)пірена та бенз(в)хризену. Наважки кількісно переносять у мірні колби місткістю 100 см 3: бенз(а)пірен-бензолом, бенз(в)хризен-ацетонітрилом, потім об'єм розчину бенз(а)пірена доводять до мітки бензолом, обсяг розчину бенз(в)хризену-ацетону. Отримані розчини мають масову концентрацію 100 мкг/см3. Розчини зберігають у холодному темному місці трохи більше трьох місяців.

5.2.4 Приготування робочих розчинів бенз(а)пірена та бенз(в)хризену

Робочі розчини готують розведенням стандартних розчинів, використовуючи піпетки місткістю 1, 5 і 10 см 3 і мірні колби місткістю 100 см 3 обсяг розчину доводять до мітки відповідним розчинником, перемішують і зберігають в холодному темному місці не більше одного місяця.

Приготування розчину бенз(а)пірена масової концентрації 1,0 мкг/см 3 (для визначення методом спектрофлуориметрії): стандартного розчину відбирають 1,0 см 3 і переносять у мірну колбу місткістю 100 см 3 ; об'єм розчину доводять до мітки бензолом.

Приготування розчину бенз(а)пірена масової концентрації 0,25: 1,0 та 5,0 мкг/см 3 (для визначення методом високоефективної рідинної хроматографії): зі стандартного розчину відбирають 0,25; 1,0; 5,0 см 3 відповідно і переносять у мірні колби місткістю 100 см 3 ; об'єм розчинів доводять до мітки ацетонітрилом.

Приготування розчинів бенз(в)хризена масової концентрації 0,5 і 10 мкг/см 3: зі стандартного розчину відбирають 0,5 і 10 см 3 відповідно, і переносять у мірні колби місткістю 100 см 3 ; об'єм кожного розчину доводять до мітки ацетонітрилом.

5.2.5 Приготування градуювальних розчинів

Для приготування градуювальних розчинів суміші бенз(а)пірена та бенз(в)хризену в мірні колби місткістю 250 см 3 піпеткою місткістю 1 см 3 переносять наведені в таблиці 2 обсяги стандартного розчину бенз(а)пірена масової концентрації 100 мкг/см розчину бенз(в)хризена масової концентрації 10 мкг/см 3 доводять об'єм до мітки ацетонітрилом. Отримані розчини перемішують та зберігають у темному холодному місці не більше одного місяця.

Таблиця 2

розчину Об'єм вихідного розчину, см 3 Масова концентрація в градуювальному розчині, мкг/см 3 Бенз(а)пірена масової концентрації 100 мкг/см3 Бенз(в)хризену масової концентрації 10 мкг/см 3 Бенз(а)пірена Бенз(в)хризена

5.3 Проведення випробування

5.3.1 Виділення бенз(а)пірену з продукту

У круглодонну колбу або плоскодонну місткістю 100 см 3 поміщають навішування продукту масою 10 г, додають розчин, що складається з 4 г гідроксиду калію в 50 см 3 92% етилового спирту. Вміст колби перемішують струшуванням. Колбу з'єднують із зворотним холодильником і нагрівають на водяній бані або на магнітній мішалці при кипінні реакційної суміші протягом 3 год. Потім колбу через холодильник додають 100 см 3 дистильованої води. Реакційну масу охолоджують до кімнатної температури. Після охолодження реакційну масу переносять у ділильну вирву місткістю 500 см 3 . У разі, якщо після гідролізу в реакційній масі залишився твердий залишок, його відокремлюють на вирві Бюхнера, промиваючи залишок на фільтрі 30 см 3 гарячого спирту. Рідку фазу реакційної маси використовують для екстракції. У ділильну вирву додають 30 см 3 н.гексану. Вміст вирви струшують і залишають для розшаровування рідин. У разі утворення емульсії до суміші в ділильній вирві додають 20 см 3 етилового спирту. Після розшаровування нижню водно-спиртову фазу зливають у колбу, а гексановий екстракт переливають в іншу ділильну вирву. Таку обробку реакційної маси проводять ще два рази, використовуючи для екстракції н.гексан по 30 см 3 та етиловий спирт для розшаровування емульсії порціями по 20 см 3 .

Після закінчення екстракції об'єднаний гексановий екстракт промивають у ділильній вирві дистильованою водою три рази по 30 см 3 переносять екстракт в круглодонну колбу місткістю 100 см 3 фільтруючи через шар безводного сульфату натрію на вирві з пористим фільтром. Розчин упарюють на ротаційному випарнику до об'єму 50 см 3 за температури водяної лазні не вище 60 °С.

Випарений екстракт переносять у ділильну вирву місткістю 500 см 3 і додають до нього 50 см 3 суміші диметилформаміду та води, взятих в об'ємному співвідношенні 9:1. Інтенсивно струшують суміш протягом 1 хв, після розшаровування фаз нижню зливають в плоскодонну колбу місткістю 200 см 3 а з верхнього гексанового шару знову проводять екстракцію 50 см 3 суміші диметилформаміду і води. Гексановий шар відкидають, об'єднаний у плоскодонній колбі диметилформамідний екстракт переносять у ділильну вирву, додають 100 см 3 дистильованої води та проводять екстракцію з водної фази гексаном тричі по 50 см 3 . Водну фазу відкидають, а гексановий екстракт промивають водою тричі по 30 см 3 переносять у плоскодонну колбу, додають 10 г безводного сульфату натрію і витримують протягом однієї години, н.гексан упарюють на ротаційному випарнику до об'єму 1,5 - 2,0 3 , що залишився розчинник видаляють

ГОСТ Р 51650-2000

потоком повітря через вакуумний алонж, з'єднаний з водоструминним насосом, залишок у колбі розчиняють 0,5 см 3 етилового спирту.

У склянку місткістю 100 см 3 відважують (2,5 ± 0,2) г сефадекса LH-20, додають 20 см 3 етилового спирту і залишають для набухання на 3 - 4 ч. Потім гель переносять, змиваючи невеликою кількістю спирту, скляну хроматографічну колонку, дають розчиннику стекти таким чином, щоб шар спирту над шаром сорбенту залишався не нижче 2 мм. На підготовлену колонку піпеткою наносять залишок екстракту з колби, тричі змиваючи його з колби етиловим спиртом порціями по 0,5 см 3 . Елюювання з колонки поліциклічних ароматичних вуглеводнів, у тому числі бенз(а)пірена, проводять 40 см 3 етилового спирту, першу фракцію об'ємом 12 см 3 відкидають, збирають другу фракцію об'ємом 25 см 3 . Швидкість елюювання розчинника 0,5 см 3 /хв забезпечують, створюючи невеликий надлишковий тиск потоком повітря або азоту через насадку, з'єднану з повітродувкою або газовим балоном. Газ слід подавати через скляну трубку, заповнену силікагелем.

Колонку із сефадексом LH-20 можна використовувати багаторазово. Для цього, не допускаючи висихання сорбенту після фракціонування, колонку промивають 25 см 3 етилового спирту та наносять наступну пробу.

Розчин другої фракції переносять в грушоподібну колбу місткістю 50 см 3 розчинник упарюють до об'єму 0,5 - 1,0 см 3 його залишок видаляють в потоці повітря або азоту.

Отриману фракцію, що містить бенз(а)пірен, далі аналізують за допомогою високоефективної рідинної хроматографії або спектрофлуориметричним методом.

Одночасно проводять контрольний досвід, проводячи всі стадії аналізу з використанням реактивів згідно з методикою, але без навішування продукту.

5.3.2 Визначення вмісту бенз(а)пірену методом високоефективної рідинної хроматографії

5.3.2.1 Умови хроматографії

Умови хроматографії підбираються в залежності від виду рідинного хроматографа і хроматографічної колонки.

Як приклад можуть бути наведені такі умови хроматографічного визначення бенз(а)пірена.

Рідкісний хроматограф "АІєх-334" з флуоресцентним детектором "Kratos FS-970".

Колонка Supelcosil LC-PAM зернянням 5 мк, довжиною 150 мм, діаметром – 4,6 мм.

Флуориметричний детектор: довжина хвилі збудливого світла 300 нм, емісійний фільтр – 418 нм.

Рухлива фаза: ацетонітрил та вода в об'ємному співвідношенні 8:2.

Швидкість елюювання – 2,0 см 3 /хв.

Об'єм проби, що вводиться - 20 мкл.

Чутливість підсилювача підбирають таким чином, щоб інтенсивність сигналів бенз(а)пірена та внутрішнього стандарту - бенз(в)хризена не перевищувала 95% шкали.

Час аналізу – 15 хв; час утримання бенз(а)пірена - 5 хв, бенз(в)хризену -13 хв.

Розчини, що аналізуються, хроматографують двічі в однакових умовах. Площі піків вимірюють за допомогою інтегратора або вручну як добуток висоти піку та його ширини на половині висоти.

Визначення вмісту бенз(а)пірена проводять методом внутрішнього стандарту чи методом добавок.

5.3.2.2 Визначення вмісту бенз(а)пірену в розчині (екстракті), отриманому за 5.3.1, методом внутрішнього стандарту

При використанні такого способу кількісної оцінки попередньо проводять градуювання хроматографа, використовуючи градуювальні розчини, приготовані за 5.2.5.

В умовах, зазначених у 5.3.2.1, записують по три хроматограми для кожного з приготовлених розчинів та вимірюють площі піків бенз(а)пірена та бенз(в)хризену. Визначають середньоарифметичне значення площі піків бенз(а)пірена та бенз(в)хризену, розраховане із трьох хроматограм.

Градуювальний коефіцієнт обчислюють за формулою

де та і 2 - маси введених в хроматограф бенз(а)пірена (/л)) та бенз(в)хризена (т 2),мкг; 5) і ^2 - площі піків бенз(а)пірена (.9)) та бенз(в)хризена (Л^), см 3 .

Градуювальний коефіцієнт розраховують для кожного розчину.

Його значення не повинні відрізнятися від середньоарифметичного значення коефіцієнта градуювання з усіх результатів більш ніж на 10 %.

При довжині хвилі збудливого світла 300 нм та емісійному фільтрі 418 нм значення градуювального коефіцієнта становить 9,5.

Перед початком аналізу на стадії підготовки проб до лужного гідролізу пробу продукту і пробу контрольного досвіду вносять по 50 мкл розчину бенз(в)хризена масової концентрації 0,5 мкг/см 3 . Обидві проби проводять через усі стадії випробування, зазначені у 5.3.1. Сухий залишок розчиняють у 200 мкл ацетонітрилу.

В умовах, зазначених у 5.3.2.1, записують хроматограми розчину бенз(а)пірена масової концентрації 100 мкг/см 3 і розчину бенз(в)хризену масової концентрації 100 мкг/см 3 відзначають час виходу бенз(а)пірена і бенз( в) хризена. Потім записують хроматограми проби контрольного досвіду з добавкою бенз(в)хризена та проби продукту з такою ж добавкою бенз(в)хризена. Вимірюють площі піків бенз(а)пірена та бенз(в)хризену на хроматограмах проби продукту та проби контрольного досвіду.

Для кожної проби записують дві хроматограми. З двох хроматограм розраховують середньоарифметичне значення площі піків бенз(а)пірена та бенз(в)хризену.

На підставі отриманих даних визначають масу бенз(а)пірена, мкг, пробі продукту т і пробі контрольного досвіду т 2 .

«72 - маса бенз(а)пірена у пробі контрольного досвіду, мкг; т ст - маса бенз(в)хризена, введеного в пробу продукту та пробу контрольного досвіду, мкг;

S"] і S 2 - площі піків бенз(а)пірена на хроматограмах проби продукту (.S"]) та проби контрольного досвіду (.S/), см 2 ;

Л/, Л/ - площі піків бенз(в)хризена на хроматограмах проби продукту (.SS) та проби контрольного досвіду (Л/), см 2;

К-градуювальний коефіцієнт, встановлений за 5.3.2.2.

5.3.2.3 Визначення вмісту бенз(а)пірену в розчині (екстракті), отриманому за 5.3.1, методом добавок

Для кількісної оцінки під час використання методу добавок одночасно з пробою продукту аналізують пробу контрольного досвіду. Фракції, виділені з проб продукту та контрольного досвіду 5.3.1, розчиняють у 400 мкл ацетонітрилу. Отримані розчини ділять на дві частини, відбираючи меншу частину (40 мкл) у пробірку або грушоподібну колбу.

Записують хроматограми проби продукту, проби контрольного досвіду та хроматограму розчину бенз(а)пірена масової концентрації 0,25 мкг/см3. Відзначають час виходу бенз(а)пірена.

У частині проби продукту і контрольного досвіду (360 мкл) роблять добавку 10 - 20 мкл розчину бенз(а)пірена масової концентрації 5 мкг/см 3 . Отримані розчини знову вводять хроматограф.

Усі хроматограми записують двічі. Вимірюють площі піків бенз(а)пірена. З двох хроматограм розраховують середньоарифметичне значення площі піку бенз(а)пірена.

На підставі отриманих даних визначають масу бенз(а)пірена, мкг, пробі продукту /77] і пробі контрольного досвіду т 2:

т оп ■ S 1 . _ т до ■ S 3 (9)

S 2 - 0,95) ' 2 5 4 - 0,95 3 '

де /77 оп та /77 k - маса бенз(а)пірена, додана до частини екстракту з проби продукту (т оп) та проби контрольного досвіду (/%), мкг;

S"] і S 2 - площі піків бенз(а)пірена на хроматограмах проби продукту (.S"]) та проби продукту з добавкою бенз(а)пірена (Л/), см 2 ;

Л/ і.S) - площі піків бенз(а)пірена на хроматограмах проби контрольного досвіду (Л/) та проби контрольного досвіду з добавкою бенз(а)пірена (Л/), см 2 ;

0,9 - частка проби, до якої роблять добавку бенз(а)пірена.

5.3.3 Визначення вмісту бенз(а)пірена методом спектрофлуориметрії при кімнатній температурі

При визначенні вмісту бенз(а)пірена методом спектрофлуориметрії одночасно з пробою продукту аналізують пробу контрольного досвіду, яку додано 50 мкл розчину бенз(а)пірена масової концентрації 1 мкг/см 3 .

Отримані по 5.3.1 фракції, що містять бенз(а)пірен, з проби продукту та проби контрольного досвіду з добавкою, розчиняють у 0,5 см 3 бензолу і далі піддають додатковому очищенню тонкому шарі ацетильованої целюлози.

Для цього пластинку 20 х 20 см, підготовлену, як зазначено в 5.2.2, ділять на два поля: бічне- шириною 1,5 - 2 см і основне, проводячи по шару сорбенту скальпелем або тонким шпателем розділювальну смугу. На основне поле суцільною смугою, відступивши 2 см від нижнього краю пластинки і по 1 см з бокових країв, розчин наносять фракції, виділеної по 5.3.1. Розчин наносять за допомогою тонко відтягнутого капіляра або мікрошприца, розмір плям не повинен перевищувати 5 мм. Для кількісного перенесення речовини його двічі змивають зі стінок колби невеликою кількістю бензолу (04-06 см 3). На стартову лінію бічного поля наносять у точку 5 мкл розчину бенз(а)пірена масової концентрації 1 мкг/см3. Після повного випаровування розчинника платівку поміщають попередньо насичену хроматографічну камеру під кутом 70° - 85° і проводять елюювання в суміші етилового спирту, ацетону і води, взятих у співвідношенні 60:25:15. Коли фронт розчинника досягне 2 см від верхнього краю пластинки, її виймають із камери, висушують на повітрі і виявляють хроматографічну зону бенз(а)пірена під лампою ультрафіолетового опромінювача. Сорбент із зони бенз(а)пірена з основного поля за допомогою скальпеля або тонкого шпателя зішкрібають з пластинки і переносять на скляний фільтр, з якого речовина елююють в декілька прийомів 50 см 3 бензолу в колби місткістю 100 см 3 , далі розчинник упарюють , залишок розчинника видаляють потоком повітря і додають колбу 1 см 3 бензолу.

На спектрофлуориметрі при довжині хвилі збудливого світла 386 нм у діапазоні 400 - 440 нм при швидкості сканування 60 нм/хв записують спектри флуоресценції проби продукту та проби контрольного досвіду з добавкою бенз(а)пірена.

Спектри розчинів записують в одному режимі посилення, регулюючи щілину і коефіцієнт посилення розчину контрольної проби так, щоб сигнал бенз(а)пірена при 406 нм становив 0,4 - 0,6 шкали приладу. Для кожного розчину спектр записують двічі, досягаючи хорошої відтворюваності. На отриманих спектрограмах максимум при 406 нм вимірюють в міліметрах висоту спектральної лінії бенз(а)пірена для проби продукту і проби контрольного досвіду. Розраховують середнє значення висот бенз(а)пірена за даними двох спектрограм. При високих рівнях вмісту бенз(а)пірена в продукті проби розбавляють бензолом і знову записують спектр у тому режимі посилення, що і для контрольної проби.

Проводять два паралельні визначення.

5.4 Обробка результатів

5.4.1 Масову частку бенз(а)пірена у продукті Х\,%, або Х 2 мг/кг, при використанні методу високоефективної рідинної хроматографії обчислюють за формулами:

(т 1 - т 2) ■ 100 (т г - т 2) т ■ 1000 1000 т 10

де mi - маса бенз(а)пірена у пробі продукту, мкг;

m2 - маса бенз(а)пірена у пробі контрольного досвіду, мкг; т - маса продукту, взята для аналізу,

5.4.2 Масову частку бенз(а)пірена в продукті А), %, або Х 2 мг/кг, при використанні методу спектрофлуориметрії обчислюють за формулами:

З ст НУ-100 з СТ // V т ■ 1000 ■ 1000 ■

де ст - масова концентрація бенз(а)пірена в робочому розчині, приготовленого по 5.2.4 і доданого в пробу контрольного досвіду, мкг/см 3 ;

висота спектральної лінії бенз(а)пірена на спектрограмі проби продукту, мм; висота спектральної лінії бенз(а)пірена на спектрограмі проби контрольного досвіду, мм;

V-об'єм робочого розчину бенз(а)пірена, доданого в пробу контрольного досвіду, см 3; т - маса навішування продукту, взятого для випробування, р.

За остаточний результат випробування приймають середньоарифметичне двох паралельних визначень з тим самим числом цифр.

Якщо розбіжність між результатами паралельних ухвал не перевищує \Х-у - ЙГ 2 |<

< 0,01 dX, где, Х 2 и X- результаты параллельных определений и их среднее арифметическое, а d - норматив контроля сходимости, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива d приведено в таблице 3.

За отриманим результатом аналізу X та значенням відносної похибки д, наведеної в таблиці 3, розраховують абсолютну похибку А = 0,(ШХ

Результат аналізу становлять у вигляді (X± А), мг/кг або % при Р = 0,95.

5.5 Контроль точності результатів аналізу

5.5.1 Схожість паралельних визначень контролюють для кожної аналізованої проби згідно з 5.3.

5.5.2 Для контролю відтворюваності використовують робочі проби. Пробу ділять на дві рівні частини та аналізують відповідно до методики у різних лабораторіях або в одній лабораторії, максимально варіюючи умови проведення аналізу, тобто використовують різні набори мірного посуду, аналізи виконують у різні дні або два різні аналітики.

Відтворюваність контрольних аналізів визнають задовільною, якщо \Х-у - Х2\<

< 0,01 DX, где Л), Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднее арифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 3.

Періодичність проведення контролю відтворюваності - не рідше одного разу на два тижні

Таблиця 3 - Діапазон вимірювань, значення характеристики відносної похибки та нормативи оперативного контролю випадкової складової відносної похибки (збіжності та відтворюваності) за довірчої ймовірності Р = 0,95

5.5.3 Для контролю точності використовують робочі проби з відомою добавкою бенз(а)пірена. Пробу ділять на дві рівні частини, першу з яких аналізують відповідно до методики, а в другу вводять відому добавку бенз(а)пірена і потім також аналізують відповідно до методики. Величина добавки повинна становити 50 - 150% вмісту бензапірену в аналізованій пробі.

Точність контрольних аналізів визнають задовільною, якщо |Л) - X- з \< К, где Л), X и с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена соответственно; К - норматив оперативного контроля точности.

Набрано у ФГУП «СТАНДАРТІНФОРМ» на ПЕОМ.

Надруковано у філії ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» - тип. "Московський друкар", 105062 Москва, Лялін пров., 6

ГОСТ Р 51650-2000

1 Область застосування............................................... ......... 1

3 Відбір проб............................................... ................ 2

4 Метод низькотемпературної спектрофлуориметрії ................................ 2

4.1 Апаратура, матеріали та реактиви......................................................... 2

4.2 Підготовка до випробування............................................... ... 3

4.3 Проведення випробування............................................... .... 3

4.4 Обробка результатів............................................... .... 6

4.5 Контроль точності результатів аналізу............ 6

5 Методи високоефективної рідинної хроматографії та спектрофлуориметрії при

кімнатній температурі................................................ ...... 7

5.1 Апаратура, матеріали та реактиви ................ 8

5.2 Підготовка до випробування............................................... ... 9

5.3 Проведення випробування............................................... ....10

5.4 Обробка результатів............................................... ....13

5.5 Контроль точності результатів аналізу.........................14

6 Вимоги техніки безпеки.............................................. 15

7 Вимоги до кваліфікації оператора..........................................15

Додаток А Бібліографія

ДЕРЖАВНИЙ СТАНДАРТ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ Методи визначення масової частки бенз(а)пірена

Методи для визначення benz(a)pyren fraction of total mass

Дата введення 2001-07-01

1 Область застосування

Цей стандарт поширюється на продовольчу сировину, харчові продукти, харчові та смакові добавки та встановлює методи визначення масової частки бенз(а)пірена із застосуванням спектрофлуориметрії за низької та кімнатної температури та високоефективної рідинної хроматографії.

Терези лабораторні загального призначення 2-го класу точності з найбільшою межею зважування 500 г за ГОСТ 24104 .

Випарник ротаційний ІР-1М.

Лазня водяна.

Електроплитка побутова із закритою спіраллю та регулятором нагрівання за ГОСТ 14919 .

Посудина Дьюара для рідкого азоту будь-якої місткості

Ванни для хроматографування (фотокювети емальовані).

Пластини скляні розміром 15 х 30 та 20 х 40 см.

Колби К-1-250-29/32 ТХС, К-1-100-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС або П-1-500-29/32 ТХС за ГОСТ 25336 .

Холодильники ХІТ-1-300-14/23 ХС або ХІТ-1-400-14/23 ХС за ГОСТ 25336 .

Холодильники ХПТ-2-400-29/32 ХС та ХПТ-1-300-29/32 або ХПТ-400-29/32 ХС за ГОСТ 25336 .

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС або дефлегматор 300-19/26-29/32 ТС за ГОСТ 25336.

Пробірки скляні П2-10-180 ХС за ГОСТ 25336.

Насадка П-1-19/26-14/23 ТС або Н2-19/23 за ГОСТ 25336.

Насос водоструминний лабораторний ГОСТ 25336 .

Піпетки місткістю 1, 2, 5, 10 см 3 за ГОСТ 29228 та ГОСТ 29229 .

Вирва ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС або ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС за ГОСТ 25336 .

Пробірки мірні П-2-15-14/23 ХС за ГОСТ 1770 .

Лійка ділильна ВД-1-500 або ВД-3-500 за ГОСТ 25336 .

Циліндри мірні 1-100, 1-250 або 3-100, 3-250 за ГОСТ 25336 .

Стаканчики для зважування (бюкси) СВ-14/8 або СВ-19/9 або СВ-24/10 або СВ-34/12 за ГОСТ 25336 .

Термометр з межами вимірювання температури 0-250 ° З ціною розподілу 1 ° С за ГОСТ 29224 .

Капіляри скляні, скляні палички.

н.октан, ч., за нормативним документом.

н.гексан, ч., за нормативним документом.

Спирт етиловий ректифікований за ГОСТ 18300 або спирт етиловий ректифікований за ГОСТ Р 51652 .

Ефір петролейний фракція 40 - 70 ° С за нормативним документом.

Алюмінію окис для хроматографії 2 ступеня активності за нормативним документом.

Бенз(а)пірен, вміст основної речовини не менше 98%.

1,12-бензперилен, вміст основної речовини не менше 98%.

Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками та обладнання з технічними характеристиками, а також реактивів та матеріалів за якістю, не нижчою від зазначених.

4.2 Підготовка до випробування

4.2.1 Очищення розчинників

Розчинники (н. октан, етиловий спирт, петролейний ефір, хлороформ і н. гексан) переганяють у загальноприйнятий спосіб з дефлегматором.

4.2.2 Підготовка окису алюмінію

Окис алюмінію висушують у сушильній шафі при температурі (250+4) °С протягом 4 год і зберігають у посудині з шліфованою пробкою.

4.2.3 Приготування розчину бенз(а)пірена для тонкошарової хроматографії (розчин «свідок»).

У бюксу відважують близько 10 мг бенз(а)пірена, доливають кілька мілілітрів петролейного ефіру до повного розчинення взятої навішування.

Отриманий розчин кількісно переносять у мірну колбу місткістю 100 см 3 і об'єм розчину доводять до мітки петролейним ефіром. Термін зберігання розчину трохи більше трьох місяців у холодильнику.

4.2.4 Приготування стандартного розчину бенз(а)пірену

У бюкс відважують (10,0 ± 0,2) мг бенз(а)пірена, доливають кілька мілілітрів н.октану до повного розчинення взятої навішування. Отриманий розчин кількісно переносять у мірну колбу з притертою пробкою місткістю 100 см 3 і доводять до мітки н.октаном. Масова концентрація бенз(а)пірену в отриманому розчині 100 мкг/см 3 . Розчин зберігають у холодильнику. Термін придатності розчину трохи більше трьох місяців.

4.2.5 Приготування робочих розчинів бенз(а)пірену

Робочі розчини бенз(а)пірена масової концентрації 0,1; 0,04 і 0,02 мкг/см 3 в н.октані готують послідовним розведенням вихідного стандартного розчину бенз(а)пірена, приготовленого по 4.2.4, у мірних колбах з притертим корком місткістю 100 см 3 . Розчини зберігають у холодильнику. Термін придатності розчинів трохи більше місяця.

4.2.6 Приготування стандартного розчину 1,12-бензперилену (внутрішній стандарт)

Для приготування вихідного розчину в бюкс відважують (10,0 +0,2) мг 1,12-бензперилену, доливають кілька мілілітрів н.октану до повного розчинення взятої навішування. Отриманий розчин кількісно переносять у мірну колбу з притертою пробкою місткістю 100 см 3 і доводять до мітки н.октаном. Масова концентрація 1,12-бензперилену в отриманому розчині 100 мкг/см 3 . Розчин зберігають у холодильнику. Термін придатності розчину трохи більше трьох місяців.

4.2.7 Приготування робочих розчинів 1,12-бензперилену (розчини внутрішнього стандарту)

Робочі розчини 1,12-бензперилену масової концентрації 0,01; 0,005; 0,002 та 0,001 мкг/см 3

готують у н.октані послідовним розведенням вихідного стандартного розчину, приготовленого по 4.2.6, у мірних колбах з притертою пробкою місткістю 100 см 3 . Розчини зберігають у холодильнику. Термін придатності розчинів трохи більше місяця.

4.3 Проведення випробування

4.3.1 Виділення бенз(а)пірену з продукту

У круглодонну колбу місткістю 500 см 3 поміщають навішення продукту масою 25 г, додають в колбу 20 см 3 дистильованої води, 200 см 3 етилового спирту та 20 г гідроксиду калію.

Вміст колби перемішують струшуванням. Колбу з'єднують зі зворотним холодильником і нагрівають на водяній бані при кипінні реакційної суміші протягом 3 год. Потім колбу через холодильник додають 150 см 3 води; колбу знімають із лазні та охолоджують до кімнатної температури.

Після охолодження рідку фазу реакційної суміші декантацією переносять у ділильну вирву, залишаючи залишок продукту в колбі. У колбу із залишком додають 150 см 3 н.гексана, вміст колби енергійно перемішують і н.гексан декантують у ділильну вирву.

Вирву закривають пробкою і енергійно струшують, потім закріплюють у штативі і залишають для розшаровування рідин. Для поділу емульсії, що утворилася, до суміші в ділильній вирві додають 20 см 3 етилового спирту. Після розшаровування нижню водно-спиртову фазу зливають назад у колбу з осадом, а гексановий екстракт переливають у колбу місткістю 500 см 3 .

Таку обробку реакційної суміші проводять ще два рази, використовуючи для екстракції н.гексан по 100 см 3 та етиловий спирт для розшаровування емульсії, порціями по 20 см 3 .

По закінченні екстракції залишок у колбі і гідролізат відкидають, а екстракт промивають у ділильній вирві дистильованою водою три рази по 50 см 3 і упарюють порціями в попередньо зваженій з точністю до другого знака після коми круглодонної колбі місткістю 250 см 3 трохи більше 60 °С. Колбу з екстрактом залишають у витяжній шафі для видалення слідів розчинника, після чого знову зважують. По різниці між зважуванням визначають масу виділеного екстракту.

Від екстракту в колбі відбирають 1/5 частину в бюкс, не зважуючи. Колбу із залишком екстракту зважують. У бюкс з частиною екстракту додають 0,1-0,2 см 3 розчину «свідка» бенз(а)пірена, приготовленого по 4.2.3. Вміст бюкси та залишок у колбі розчиняють у невеликому обсязі петролейного ефіру.

Для хроматографічного поділу екстракту на скляну пластину розміром 20×40 см рівномірно насипають окис алюмінію. Потім за допомогою скляної палички, розділеної на три частини (14, 1 і 3 см) гумовими кільцями товщиною 1 мм та шириною 3 мм, ретельно розрівнюють окис алюмінію.

Отримані розчини кількісно наносять на підготовлену пластину скляними капілярами: на вузьку частину – розчин із бюкси («свідок»), на широку – екстракт продукту з колби. Розчини наносять рівномірно суцільною смугою, відступивши від нижнього краю пластини 7 – 8 см.

Пластину поміщають у ванну для хроматографування під невеликим 20 - 25 кутом, наливають петролейний ефір так, щоб він не доходив до лінії нанесення проби. Ванну накривають склом та проводять хроматографію, доводячи фронт розчинника до верхнього краю пластини.

Не висушуючи пластину, опромінюють її ультрафіолетовим світлом і по смузі «свідка», що світиться, визначають місце знаходження бенз(а)пірена в досліджуваній пробі. Відзначають межі смуги бенз(а)пірену на хроматограмі досліджуваної проби. Пластину висушують на повітрі у витяжній шафі.

Зазначену на хроматограмі досліджуваної проби смужку окису алюмінію за допомогою предметного скла знімають із пластини і кількісно переносять на пористу пластину воронки, що фільтрує. Вирву з'єднують з круглодонною колбою місткістю 100 см 3 і бенз(а)пірен елююють з окису алюмінію 50 см 3 бензолу, додаючи бензол невеликими порціями і перемішуючи оксид алюмінію на вирві паличкою. Бензол упарюють насухо на ротаційному випарнику при температурі водяної лазні не більше 60 °С. Залишок у колбі октаном кількісно переносять у пробірку. Об'єм розчину в пробірці не повинен перевищувати 5 см 3 .

При аналізі деяких продуктів не відбувається повного та чіткого поділу флуоресціюючих компонентів зразка при первинному хроматографуванні виділеного з продукту екстракту. І тут на пластині виділяють ширшу смужку окису алюмінію лише на рівні «свідка»; бенз(а)пірен елююють з окису алюмінію бензолом так, як описано вище, і залишок після упарювання розчиняють у етиловому спирті та отриманий спиртовий екстракт повторно хроматографують.

Для хроматографічного поділу спиртового екстракту використовують пластину розміром 15 х 30 см завтовшки шару окису алюмінію 0,3 мм. На пластині відокремлюють дві смуги шириною 10 і 3 см. На широку частину пластини наносять за допомогою скляного капіляра спиртовий екстракт продукту, що аналізується, на вузьку - розчин бенз(а)пірена в петролейному ефірі (розчин «свідок»), Пластину поміщають у ванну під кутом 20 - 25° і проводять хроматографію у хлороформі, доводячи фронт розчинника до верхнього краю пластини. В ультрафіолетовому світлі відзначають за свідком смугу окису алюмінію з бенз(а)піреном досліджуваного продукту. Потім бенз(а)пірен елююють з окису алюмінію бензолом і проводять усі подальші операції так, як зазначено вище.

ГОСТ Р 51650-2000

Розчин бенз(а)пірена в н.октані переносять у пробірку. Об'єм розчину не повинен перевищувати 5 см 3 при вихідному навішуванні продукту 25 г.

В отриманому розчині (екстракт) визначають вміст бенз(а)пірена методом низькотемпературної спектрофлуориметрії, використовуючи для кількісної оцінки метод добавок або метод внутрішнього стандарту.

4.3.2 Визначення вмісту бенз(а)пірену в розчині (екстракті), отриманому за 4.3.1, методом добавок.

У три пробірки наливають піпеткою по 1 см 3 отриманого розчину бенз(а)пірена в н.октані. Потім до першої пробірки доливають 2 см 3 н.октану. У другу пробірку доливають 1,5 см 3 н.октану і 0,5 см 3 робочого розчину бенз(а)пірена масової концентрації 0,1 мкг/см 3 приготовленого по 4.2.5. У третю пробірку вносять 1 см 3 н.октану і 1 см 3 того самого робочого розчину бенз(а)пірена, що й у другу пробірку.

Спектрофлуориметричний аналіз починають із третьої пробірки. Для цього третю пробірку поміщають у посудину Дьюара з рідким азотом перед вхідною щілиною спектрофотометра; встановлюють аналітичну лінію флуоресценції бенз(а)пірена 403 нм при довжині хвилі збудливого світла 367 нм. Регулюванням коефіцієнта посилення і розкриттям щілини, а також одночасною юстировкою пробірки в посудині Дьюара добиваються максимального сигналу по реєструючого приладу спектрофотометра (до 50 - 80 %), після чого записують спектрограму бенз(а)пірена в області 401 - 404 н спектрофотометр при довжині хвилі 401 нм. Запис спектру повторюють двічі.

Потім послідовно заморожують у рідкому азоті другу і першу пробірки та записують спектри флуоресценції в області довжин хвиль 401 - 404 нм, обов'язково виставляючи перо самописця при довжині хвилі 401 нм у те саме положення, що при скануванні проби в третій пробірці.

Масову концентрацію бенз(а)пірена в аналізованому екстракті визначають за графіком, на якому по осі абсцис відкладають значення добавки бенз(а)пірена (мкг), а по осі ординат - висоту піку максимуму характеристичної лінії бенз(а)пірена при 403 нм, виміряну за отриманими спектрограмами в міліметрах.

Якщо масова концентрація бенз(а)пірена в досліджуваному розчині потрапляє в область, придатну для вимірювань, отримані експериментальні точки лежать на одній прямій. Екстраполяція цієї прямої до перетину з віссю абсцис дає на ній відрізок, що відповідає вмісту бенз(а)пірена в розчині без добавки, тобто 1 см 3 досліджуваного розчину. У випадку, якщо масова концентрація бенз(а)пірена в аналізованому розчині вище верхньої межі діапазону вимірюваних приладом концентрацій, проводять розведення аналізованого розчину н.октаном.

4.3.3 Визначення вмісту бенз(а)пірену в розчині (екстракті), отриманому за 4.3.1, методом внутрішнього стандарту

Як внутрішній стандарт використовують 1,12-бензперилен. У пробірку наливають 3 см 3 розчину бенз(а)пірена в н.октані, отриманого по 4.3.1, і поміщають у судину Дьюара з рідким азотом перед вхідною щілиною спектрофотометра, встановлюють аналітичну лінію 403 нм при довжині хвилі збуджуючого світла запис спектру розчину області довжин хвиль 401 - 409 нм. По інтенсивності лінії (за висотою піку максимуму характеристичної лінії бенз(а)пірена при 403 нм) оцінюють приблизний вміст бенз(а)пірена у пробі. Відповідно до цієї оцінки далі в пробірку з 3 см 3 розчину бенз(а)пірена в н.октані додають розчин 1,12-бензперилену в такій кількості, щоб у спектрі проби інтенсивність 1,12-бензперилену при

406.3 нм була в 3 - 5 разів більша за інтенсивність лінії бенз(а)пірена при довжині хвилі 403 нм.

Проводять запис спектра в інтервалі довжин хвиль 401 – 409 нм двічі.

Інтенсивності характеристичних ліній бенз(а)пірена при 403 нм та 1,12-бензперилену при

406.3 нм (Н| і Н 2 відповідно) визначають за спектрограмами, вимірюючи висоти піків у максимумах характеристичних ліній цих сполук у міліметрах. У розрахунках беруть середню величину. Розраховують коефіцієнт відношення (К) інтенсивності лінії бенз(а)пірена (ЕГД до інтенсивності лінії 1,12-бензперилену (ЕГ 2), К = //]/// 2 .

Далі визначають цей коефіцієнт для стандартних розчинів бенз(а)пірена (Х ст). Для цього на дві пробірки наливають по 3 см 3 стандартних розчинів бенз(а)пірена з масовою концентрацією 0,02 і 0,04 мкг/см 3 . У кожну з пробірок наливають таку ж кількість 1,12-бензперилену, що і пробірку з пробою. Двічі записують спектрів кожного розчину в інтервалі довжин хвиль 401 - 409 нм.

При цьому обов'язково стежать, щоб положення пера самописця при довжині хвилі 401 нм у всіх випадках фіксувалося на одному рівні.

Далі спектрограмами визначають інтенсивність характеристичних ліній бенз(а)пірена при 403 нм і 1,12-бензперилену при 406,3 нм (Щ і Н 2 відповідно). У розрахунках набувають середнього значення. Розраховують К ст = Н^Н 2 кожної концентрації бенз(а)пирена.

Масову концентрацію бенз(а)пірена в аналізованому розчині, мкг/см 3 , обчислюють за формулою:

з ст *К/К ст, (1)

де ст - концентрація бенз(а)пірена в стандартному розчині, мкг/см 3 ;

К-коефіцієнт, знайдений за спектрограмою аналізованого розчину з добавкою 1,12-бензперилену;

К С1 - коефіцієнт, знайдений за спектрограм стандартного розчину бенз(а)пірена з добавкою 1,12-бензперилену, значення якого ближче за значенням до коефіцієнта аналізованого розчину з відповідною добавкою 1,12-бензперилену.

Проводять два паралельні визначення і одночасно контрольний досвід, який проводять через всі стадії аналізу з використанням всіх реактивів згідно з методикою, але без навішування продукту.

4.4 Обробка результатів

Масову частку бенз(а)пірена Л), %, X і Х 2 мг/кг, обчислюють за формулами:

= (с - ер) ■m l V ■ 100 = (с - ер) ■ т 1 ■ V (2)

3 т 2 ■ т ■ 1000 ■ 1000 т 2 ■ т ’

_ (з - с 0) ■ V ■ т 1 (3)

де з - концентрація бенз(а)пірена, встановлена ​​по 4.3.2 або 4.3.3 у розчині (екстракті) аналізованого продукту, отриманого за 4.3.1, мкг/см 3 ; з 0 - концентрація бенз(а)пірена в розчині контрольного досвіду, отриманого 4.3.1, мкг/см 3 ; V-об'єм розчину бенз(а)пірена, виділеного з аналізованої проби продукту, см 3;

/«I - маса екстракту, виділеного з аналізованого продукту, г; т 2 - маса екстракту, нанесеного на широку смугу пластини г; т - маса навішування продукту, р.

Результат округляють до другої цифри.

За остаточний результат визначення приймають середньоарифметичне двох паралельних визначень з тим самим числом цифр.

Якщо розбіжність між результатами паралельних визначень вбирається у |Л) - Х 2 \<

< 0,01яЖ, где Xi, Х 2 и X- результаты первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое, a d- норматив контроля сходимости, то среднеарифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива контроля сходимости d приведено в таблице 1.

За отриманим результатом аналізу X та значенням відносної похибки д, наведеної в таблиці 1, розраховують абсолютну похибку А = 0,(ШД мг/кг або %).

Результат аналізу представляють у вигляді (X ± А), мг/кг або % за Р = 0,95.

4.5 Контроль точності результатів аналізу

Внутрішній оперативний контроль (ВОК) якості результатів аналізу включає контроль збіжності, відтворюваності та точності результатів аналізу.

4.5.1 Схожість паралельних визначень контролюють для кожної аналізованої проби згідно з 4.4.

4.5.2 Для внутрішнього контролю відтворюваності використовують робочі проби. Пробу ділять на дві рівні частини та аналізують відповідно до методики у різних лабораторіях або в одній лабораторії, максимально варіюючи умови проведення аналізу, тобто використовують різні набори мірного посуду, аналізи виконують у різні дні або два різні аналітики.

Відтворюваність контрольних аналізів визнають задовільною, якщо Х - Х 2<

< 0,01 DX, где X/, Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднеарифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 1.

ГОСТ Р 51650-2000

Періодичність проведення контролю відтворюваності – не рідше одного разу на два тижні.

Таблиця 1- Діапазон вимірювань, значення характеристики відносної похибки та нормативи оперативного контролю випадкової складової відносної похибки (збіжності та відтворюваності) при довірчій ймовірності Р = 0,95

4.5.3 Для контролю точності використовують робочі проби з відомою добавкою бенз(а)пірена. Пробу ділять на дві рівні частини, одну з яких аналізують відповідно до методики; у другу - вводять відому добавку бенз(а)пірена і потім також аналізують відповідно до методики. Величина добавки повинна становити 50 - 150% вмісту бензапірену в аналізованій пробі.

Точність контрольних аналізів визнають задовільною, якщо \Ху-X-с\< 0,01 К, где Ху, Xи с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена, соответственно; К- норматив оперативного контроля точности. Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формулам: при проведении внутрилабораторного контроля (Р = 0,90)

К = 0,84 V (А Х]) 2 + (А х) 2; (4)

під час проведення зовнішнього контролю (Р = 0,95)

К = V (А ^) 2 + (A z) 2 , (5)

де А^ + Ах - значення характеристики похибки, що відповідають масовій концентрації

бенз(а)пірена в пробі з добавкою та в реальній пробі;

Ау, = 0,01 Ху та А х = 0,01д х Х, де Ху та X- масова частка бенз(а)пірена в пробі з добавкою

та в реальній пробі, % або мг/кг.

Значення відносної похибки д х (8у) наведено у таблиці 1.

Контроль точності аналізу проводять не рідше одного разу на місяць, а також за зміни реактивів або після тривалої перерви в роботі.

У разі перевищення нормативів оперативного контролю точності проводять повторні аналізи. При повторному перевищенні зазначених нормативів аналізи призупиняють, з'ясовують причини, що призводять до незадовільних результатів, та усувають їх.

Результати ВОК заносять у спеціальний журнал.

5 Методи високоефективної рідинної хроматографії та спектрофлуориметрії при кімнатній температурі

Сутність методу полягає в екстракції вуглеводнів, у тому числі бенз(а)пірена, гексаном з продукту, попередньо обробленого спиртовим розчином їдкого калію, виділенні фракції поліциклічних ароматичних вуглеводнів, що містить бенз(а)пірен, очищенні отриманої фракції від домішок, що заважають, та в тонкому шарі ацетильованої целюлози з подальшим кількісним визначенням виділеного бенз(а)пірена високоефективною рідинною хроматографією або спектрофлуориметрією при кімнатній температурі.

Діапазон визначених величин масової частки бенз(а)пірена в аналізованих продуктах при використанні методу високоефективної рідинної хроматографії та методу спектрофлуориметрії при кімнатній температурі 0,0001-0,002 мг/кг або 0,1 х 10 -7 - 2,0 х 10 -7 % . Оптимальний діапазон масових концентрацій бенз(а)пірена в розчині при використанні методу високоефективної рідинної хроматографії становить 0,01-0,02 мкг/см 3 , при використанні методу спектрофлуориметрії - 0,02-0,2 мкг/см 3 .

Бензапірен відноситься до класу поліциклічних ароматичних вуглеводнів - ПАУ. Це група органічних сполук, у хімічній структурі яких є бензольні кільця — групи від трьох кілець і більше. Хімічне визначення бензапірену: органічна речовина, що містить вуглець, що входить до групи поліциклічних вуглеводнів, з молярною масою 252,31 г/моль.

Що таке бензапірен

Бензапірен, як і всі ПАУ, головним чином результат технічного прогресу, наслідок діяльності людини. Основні джерела техногенного забруднення ПАУ - спалювання твердих та рідких органічних речовин, у тому числі нафти та нафтопродуктів, деревини, антропогенних відходів. З природних джерел бензапірену варто відзначити лісові пожежі, виверження вулканів.

Однак утворення бензапірену може відбуватися і без процесів горіння - при піролізі, тлінні, полімеризації.

Бензапірен виділяється при курінні: вміст бензапірену в димі однієї сигарети в середньому становить 0,025 мкг, що у багато разів перевищує ГДК (у середньому в 10 000 -15 000 разів). Було підраховано, що викурювання однієї сигарети за вмістом бензапірену рівнозначне шістнадцятій годині вдихання вихлопних газів.

Формула бензапірену

Існує два ізомери бензапірену. Перший - 1,2-бензапірен (3,4-бензпірен) - , що міститься у всіх продуктах горіння - нафти, смолі, вугіллі, димі різного походження, у тому числі . У чистому вигляді це голкоподібні кристали або пластинки світло-жовтого кольору з температурою плавлення близько 177 °С.

4,5-Бензопірен - кристали у вигляді голок та пластинок світло-жовтого кольору, з температурою плавлення 179°С. Міститься в кам'яновугільній смолі, виявляється у ґрунтах (особливо поблизу підприємств та автомобільних доріг). Мутагенним, канцерогенним властивостями не має.

Хімічна формула бензапіренів - C20H12.

Бензапірен у грунті та повітрі

Бензапірен практично не зустрічається у вільному стані, а завжди осаджується на частинках, що містяться у повітрі. Разом з масами повітря, що пересуваються, бензапірен розноситься по великій площі, а випадаючи разом з твердими частинками з повітря (наприклад, при опадах) потрапляє в ґрунтові шари, водойми, на поверхні будівель.

У міграції та накопиченні бензапірену відіграє роль і таке його джерело, як автомобільний транспорт. З одного боку, пересуваючись на великі відстані, автомобілі сприяють рівномірному розносу бензапірену. З іншого боку, бензапірен, що осів, у великих кількостях накопичується вздовж автомобільних доріг і на об'єктах поряд з ними (так звані «вторинні джерела»).

Бензапірен легко «включається» в кругообіг речовин у природі: з атмосферними опадами, що завжди містять тверді частинки, він заноситься навіть на території, віддалені від основного джерела ПАУ, потрапляє у водоймища, звідки, при процесах випаровування, знову піднімається в повітря. Саме така здатність бензапірену мігрувати призводить до того, що його вміст може бути високим у місцях, де немає потужного джерела цієї речовини.

Потрапляючи в навколишнє середовище і накопичуючись у ньому, бензапірен проникає в рослини, які надалі служать кормом для худоби або використовуються у харчуванні людини. Концентрація бензапірену в рослинах вище, ніж його вміст у ґрунті, а в продуктах харчування (або кормах) вище, ніж у вихідній сировині для їх виготовлення. Цей ефект нарощування концентрації хімічних речовин, у тому числі бензапірену, отримав назву біоакумуляції.

Таким чином, бензапірен становить небезпеку не тільки як фонове забруднення навколишнього середовища, але і як речовина, що проникає в організм по харчовому ланцюжку.

ГДК бензапірену

Основний метод визначення та контролю бензапірену - метод рідинної хроматографії.

Відповідно до Гігієнічних нормативів 2.1.6.695-98 та 2.1.6.1338-03 гранично допустима середньодобова кількість бензапірену в повітрі (ПДКсс) - 0,1 мкг/100 м3 або 10-9 г/м3, а ГДК його в ґрунті за Гі. 7.2041-06 – 0.02 мг/кг у сумі з урахуванням фонового рівня. У повітрі на робочих місцях середньозмінна ГДК не більша за 0,00015 мг/куб.м. (З п.1. та п.2. ГН 2.2.5. 1313-03).

ГДК бензапірену у воді не більше 0,000001 мг/л, у питній воді при централізованій системі водопостачання – не більше 0,000005 мг/л. У бутильованій питній воді – від не більше 0,001 мкг/л (вода найвищої якості) до не більше 0,005 мкг/л у бутильованій воді першої категорії якості.

У продуктах харчування, в яких допустима наявність бензапірену через технологічні особливості, допустимий рівень бензапірену не більше 0,001 мг/кг. До них відносяться: ковбасні вироби та вироби з використанням субпродуктів, у тому числі копчені; сало копчене; ковбасні вироби та копченості з м'яса та субпродуктів птиці; копчений консерви та пресерви з риби, риба копчена; зерно продовольче.

При використанні коптильних ароматизаторів вміст бензапірену не більше 2 мкг/кг(л), а після їх використання вміст бензапірену в готових продуктах не повинен перевищувати 0,03 мкг/кг(л).

В інших продуктах харчування наявність бензапірену не допускається.

Проте за результатами моніторингу, норми вмісту бензапірену перевищені у багато разів. У середньому, рівень забруднення повітря в містах вищий за ГДК у 5—12 разів, у ґрунтах — у 3-7 разів, у продуктах харчування — від 1,5 до 11 разів.

Вплив бензапірену на організм людини

Бензапірен віднесено до речовин першого класу небезпеки. Перший клас небезпеки - це речовини з надзвичайно високою небезпечною дією на навколишнє середовище, при цьому зміни, які вони викликають, незворотні та відновлення не підлягають.

Бензапірен - один із найпотужніших і при цьому широко поширений канцероген. Будучи хімічно і термічно стійким, маючи властивості біоакумуляції, він, потрапивши і накопичуючись в організмі, діє постійно і потужно. Крім канцерогенного, бензапірен має мутагенну, ембріотоксичну, гематотоксичну дію.

Шляхи проникнення бензапірену в організм різноманітні: з їжею та водою, через шкіру та шляхом вдихання. Ступінь небезпеки залежить від того, яким шляхом відбулося попадання бензапірену в організм. В експериментах, а також за даними моніторингу екологічно несприятливих районів, бензапірен впроваджується до комплексу ДНК, викликаючи незворотні мутації, що переходять у наступні покоління. Особливу тривожність викликає факт біоакумуляції бензапірену: ймовірність розвитку мутацій у найближчих поколінь потомства зростає через біоакумуляцію в багато разів.

ХОЧЕТЕ КИНУТИ КУРИТИ?

Тоді вам до нас на марафон за відмовою від сигарет.
За його допомогою покинути буде набагато простіше.

4.1.2. Методика виконання вимірювань масової частки бенз(а)пірена в продовольчій сировині, харчових продуктах та ґрунті методом високоефективної рідинної хроматографії.

Призначення та сфера застосування

Методика призначена для кількісного визначення бенз(а)пірена (БП) у продовольчій сировині, харчових продуктах та ґрунті при його масовій частці, зазначеній у табл. 1. Нижня межа діапазону вимірювань відповідає 1/2 допустимого рівня (змісту) токсину в продуктах та сировині, верхня межа – п'ятикратному перевищенню допустимого рівня.

Бенз(а)пірен - високотоксична канцерогенна сполука, та її допустимий вміст у харчових продуктах та продовольчій сировині встановлюється Санітарними правилами та нормами СанПіН 2.3.2.560-96.

Методика може бути застосована установами Держсанепіднагляду РФ, лабораторіями інших організацій та підприємств, пов'язаними з дослідженнями, хімічним аналізом та сертифікацією продуктів харчування. Методика не є арбітражною.

Рис. 11.14.

• 1. Нафталін 9. Хризен (0,17 *)
• 2. Аценафтен (1,40*) 10. Бенз(а)пірен
• 3. Флуорен (2,60*) 11. Бенз(Ь)флуорантен (0,26*)
• 4. Фенантрен *2,40*) 12. Бенз(к)флуорантен (0,10*)
• 5. Антрацен (0,13*) 13. Бенз(а)пірен (0,2*)
• 6. Флуорантен (0,74 *) 14. Дібенз (а, Ь) антрацен
• 7. Пірен (0,67 *) 15. BeH3 (g, h, i) nepHaen (0,21 *)
• 8. Бенз(а)антрацен (0,07*) 16. Індено(1,2,3-сс1)пірен (0,26*)

Умови аналізу:

Колонка: Supelcosil® LC РАН (250 мм х 2,1 мм; 5 мкм);

Ацетонітрил (А) 50-100%, вода (В) 50-0%; 200 мкл/хв Температура: 25 °С Об'єм проби: 10 мкл Детектування: СФлу, за програмою

Характеристики похибки вимірів

Межі відносної похибки (±5) результату вимірювання масової частки БП (при довірчій ймовірності 0,95) наведено в табл. 1.

Таблиця 1.Аналізовані об'єкти, діапазони та характеристики вимірювань

Група продуктів (об'єкт, що аналізується)	Допустимий зміст ( IV X),мг/кг	Діапазон вимірювань масової частки БП, мг/кг	Коефіцієнт вилучення,	Межі відносної похибки (±8), %
Копчені м'ясні, рибні та жирові продукти

Засоби вимірювань, допоміжні пристрої, матеріали та реактиви

Засоби вимірювань

Хроматографи рідинні:

• - Мікроколоночний "Міліхром-5", ТУ 25-7405.0009-89, виконання 3 з флуориметричним (ФлД) детектором (Варіант 1).
• - Ізократичний або градієнтний рідинний хроматограф, наприклад "Кпаієг" (Німеччина), Держреєстр засобів вимірювань РФ 16848-97 або Приставка хроматографічна "ВЕРХ-3", ТОВ "Люмекс" (С.-Петербург), забезпечені ФЛД "Флюорат-02" -2М », ТОВ «Люмекс», Держреєстр засобів вимірювань РФ 14093-99 (Варіант 2).
• - Ізократичний або градієнтний рідинний хроматограф з ФЛД будь-якого типу, наприклад "Кпаієг" (Німеччина), Держреєстр засобів вимірювань РФ 16848-97 (Варіант 3).

Колонки хроматографічні «Діасфер-110-С 16», ТУ 4215-001-05451931-94, ЗАТ «БіоХімМак СТ» (Москва), з типорозмірами, що відповідають варіанту хроматографічної системи:

• – 2 х 80 мм, dp = 5 – 7 мкм (Варіант 1)
• – 2 х 150 мм, dp = 5 – 7 мкм (Варіант 2)
• – 4 х 150 мм, dp = 5 – 7 мкм (Варіант 3)

Програмно-апаратний комплекс «МультиХром-Спектр», ТУ АЖРЦ

3.036.001, ЗАТ «Амперсенд» (Москва), або будь-яке інше програмне забезпечення, що дозволяє проводити градуювання та кількісне визначення методом зовнішнього стандарту.

ДСО 7515-98 складу розчину бенз(а)пірена в ацетонітрилі з масовою концентрацією бенз(а)пірена 100 мкг/см 3 АТЗТ «Екрос» (С.-Петербург).

ДСО 7064-93 складу розчину бенз(а)пірена в гексані з масовою концентрацією бенз(а)пірена 100 мкг/см 3 АТЗТ «Екрос» (С.-Петербург).

Ваги електронні лабораторні 4 кл. точності моделі ВЛЕ 134, ГОСТ 24104-88 абодр.

Мікрошприци місткістю 100 мкл фірми Hamilton, модель Microliter #1710 або аналогічні.

Мікропіпетки 0,5; 0,2; 0,1 мкл; ГОСТ 20292-74.

Циліндри мірні 2-25,2-50, 2-100 та 2-500, ГОСТ 1770-74.

Колби мірні 2-10-2, 2-100-2, ГОСТ 1770-74.

Піпетки градуйовані 1, 2, 5, 10 см 3 ГОСТ 29227-91.

Реактиви та матеріали

Ацетонітрил для рідинної хроматографії, ОП-3 осч, ТУ 6-09-14-2167-84, ректифікований.

Вода бідистильована, ТУ 6-09-2502-77.

Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78, висушений над Na 2 S 04 , ректифікований.

Бензол, х.ч., ГОСТ 5955-75, висушений над Na 2 S 04 , ректифікований.

Сульфат безводний натрію, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Концентруючі патрони "Діапак": А-3, П-3, С; ТУ 4215-002-05451931-94, ЗАТ «БіоХімМак СТ» (Москва).

Допоміжні пристрої

Система для фільтрації та дегазації елюентів ЗАТ «БіоХімМак СТ» (Москва) або ін.

Скляні флакони для градуювальних і аналізованих розчинів місткістю 1,8 і 5,0 см 3 з кришками, що загвинчуються, і тефлоновими прокладками фірми Supelco, номери за каталогом 2-6951, 2-7037 і

2-7039 або аналогічні.

Мікрозмішувач ППЕ-3, "Екрос" (С.-Петербург).

Випарник ротаційний ІР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 або ін.

Колби гостродонні з пробками місткістю 25, 10 і 5 см 3 ГОСТ 25336.

Пристрій для віддування розчинів у струмі азоту, забезпечений алюмінієвим блоком (сухоповітряною лазнею), що термоста- тується, СП «БіоМарк» (Львів) або ін.

Мембранні фільтри з DP = 0,4-0,5 мкм.

Пристрій для створення вакууму близько 7 мм рт. ст. (Водоруйновий насос, ГОСТ 25336; водокільцевий вакуумний насос «Бегемот», НВК-РК2/1, ЗАТ «БіоХімМак СТ», Москва).

Вакуумний пристрій для підготовки проб (вакуумний маніфолд) або ін з приймачами проб місткістю не менше 10 см 3 .

Колба Бюхнера, вирва Бунзена місткістю не менше 500 і 200 см 3 відповідно, ГОСТ 1770.

Вирва ділильна місткістю 100 і 500 см 3 , ГОСТ 25336.

Колби плоскодонні конічні з пробками місткістю 50, 100 і 250 см 3 ГОСТ 25336.

Колби грушоподібні з пробками місткістю 50 і 100 см 3 ГОСТ 25336.

Вирва конічна діаметром не менше 10 см, ГОСТ 1770.

Папір фільтрувальний типу «синя стрічка».

Вата медична нестерильна, бавовняна.

Метод вимірів

Методика включає такі основні процедури:

• - первинна екстракція гексаном та переекстракція в ацетонітрил БП із проби копченого продукту;
• - первинна екстракція БП сумішшю ацетонітрил-вода із проби зерна або ґрунту;
• - концентрування та очищення первинного екстракту методом твердофазної екстракції;
• - розведення підготовленого екстракту проби сумішшю ацетонітрил-вода;
• - градуювання хроматографа за розчинами з відомим значенням масової концентрації БП;
• - аналіз розчину підготовленого екстракту проби методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) із реєстрацією сигналу флуоресценції;
• - ідентифікація визначається БП за параметрами утримування;
• - обчислення масової концентрації БП на основі зареєстрованого аналітичного сигналу та градуювальної характеристики;
• - Обчислення масової частки БП, виходячи з масової концентрації БП, маси харчової проби та об'єму розчину підготовленого екстракту.

Вимоги безпеки

При роботі з використовуваними хімічними сполуками необхідно дотримуватись вимог безпеки, встановлених для робіт з токсичними, їдкими та легкозаймистими речовинами, ГОСТ 12.1.018-86 та ГОСТ 12.1.004-76, вимоги пожежної безпеки, ГОСТ 12.1.004-76.

При попаданні розчинів БП на шкіру або поверхні предметів необхідно обробити їх водою з миючим засобом, а потім етиловим спиртом. Розчини повинні зберігатися в холодильнику в герметичній упаковці.

При експлуатації системи для ВЕРХ та проведенні відповідних вимірювань необхідно дотримуватись правил електробезпеки, ГОСТ

12.1.019-79 та інструкцію з експлуатації приладу.

Вимоги до кваліфікації операторів

До роботи допускаються особи:

• - що мають кваліфікацію інженера-хіміка або техніка-хіміка;
• - мають досвід роботи у хімічній лабораторії;
• - пройшли відповідні курси навчання та стажування в лабораторіях, акредитованих на виконання аналізів із застосуванням ВЕРХ;
• - отримали позитивні результати під час виконання контрольних операцій.

Умови виконання вимірювань

Підготовку проб, приготування розчинів, підготовку та виконання вимірювань проводять при температурі навколишнього повітря 18-25 °С, атмосферному тиску 84,0-100,7 кПа (630-800 мм рт. ст.), вологості повітря не більше 80% (при температурі 25 ° С).

При вимірюваннях в лабораторії повинні бути дотримані такі умови: напруга в мережі 220±10 В, частота струму в мережі 50ж 1 Гц. Вимірювання проводять в умовах, рекомендованих описом та інструкцією з експлуатації.

Підготовка до виконання вимірювань

Скляний посуд

Використаний скляний посуд перед подальшим вживанням обполіскують останнім з розчинників, що застосовувалися і ретельно миють гарячою водою з будь-яким миючим порошком, обполіскують послідовно дистильованою і бидистиллированной водою і сушать. Чистий посуд зберігають, закривши пробкою або ватним тампоном.

Відбір проб, зберігання та поводження з ними

Відбір та усереднення проб проводять відповідно до нормативних документів на кожний вид продукції (ГОСТ 13586.3-83, ГОСТ 27668-88, ГОСТ 9792-73, ГОСТ 7631-85). Визначається БП вилучають із проб копчених продуктів екстракцією сухим гексаном, після упарювання якого проводять його переекстракцію в ацетонітрил. При вилученні БП із проб зерна або ґрунту використовують суміш вода-ацетонітрил (16:84). Наступні концентрування та очищення первинного екстракту проби, що містить БП, незалежно від характеру вихідного продукту виконують відповідно до комплексної схеми твердофазної екстракції з використанням трьох концентруючих патронів Діапак А-3, П-3, С.

Підготовлені проби (екстракти проб) розчиняють у суміші ацетонітрил-вода (70:30).

Кожне вимірювання масової частки БП включає підготовку та хроматографічний аналіз не менше двох проб.

Приготування сумішей розчинників

Суміші розчинників готують об'ємним методом у мірних циліндрах. Необхідні об'єми ацетонітрилу та води відміряють окремими мірними циліндрами, а потім змішують. Екстрагент А: суміш ацетонітрил-вода (84:16).

Приготування екстрагентів

Для приготування взаємнонасичених ацетонітрилу та гексану в ділильній вирві місткістю 500 см 3 струшують близько 300 см 3 ацетонітрилу та 100 см 3 гексану. Після розшарування розчинників роздільно відбирають шари: нижній (ацетонітрил, насичений гексаном - екстрагент Б) і верхній (гексан, насичений ацетонітрилом - екстрагент В), інтерфазу відкидають.

Приготування елюентів

Для проведення вимірювань методом ВЕРХ готують суміші ацетонітрил-вода в наступних співвідношеннях: (90:10) - елюент 90, (84:16) - елюент 84, (80:20) - елюент 80, (70:30) - елюент 70. Готові елюенти фільтрують через мембранний фільтр та проводять вакуумну або термічну дегазацію.

Приготування градуювальних розчинів

ДСО складу розчину БП в ацетонітрилі (див. вище) перед використанням розбавляють сумішшю ацетонітрил-вода (7:3). Піпеткою відбирають

1,0 см 3 вихідного розчину, перешкодять мірну колбу місткістю 100 см 3 і додають розчинник до мітки. Далі піпеткою відбирають певні обсяги отриманого розчину, перешкодять їх у мірну колбу місткістю 10 см 3 і розчинник додають до мітки. Відповідні об'єми розчинів, що використовуються для розведення, та концентрації градуювальних розчинів 2-5 (Варіант 1) та 3-7 (Варіанти 2, 3) вказані в табл. 2. При використанні ДСО складу розчину БП в гексані (див. нижче) після упарювання розчинника в умовах, наведених нижче, сухий залишок перерозчиняють в ацетонітрилі та розбавляють, як описано вище, з урахуванням значення атестованої концентрації ДСО.

Таблиця 2.Розчини для градуювання під час аналізу бензопірену (БП)

Масова концентрація БП (атестоване значення ДСО), мкг/см 3	Вихідний розчин для розведення		Градуювальний
				Масова концентрація БП, мкг/см3

*Не використовується для безпосереднього градуювання хроматографічної системи.

Підготовка хроматографічної системи

Хроматограф включають і готують до роботи відповідно до його опису та керівництва до експлуатації. Встановлюють колонку «Діасфер-110-16» з типорозмірами відповідно до варіанту хроматографа (див. вище). Прокачують через хроматографічну систему елюенти з найбільшою концентрацією ацетонітрилу до стабілізації базової лінії детектора, а потім кондиціонують її в початкових умовах градієнта за відповідними розділами «Умови проведення аналізу».

Підготовка концентруючих патронів

Концентруючі патрони Діапак А-3 та П-3 готують до роботи наступним чином:

• 1. У поліпропіленовий корпус об'ємом 10 см 3 зі змінним фільтром у нижній частині засипають 3 см 3 сухого сорбенту Діапак А або П. Верхню порожню частину корпусу використовують як вирву для нанесення проби або елюенту.
• 2. Закріплюють патрон вертикально у відповідному пристрої для вакуумування та формують постукуванням рівний горизонтальний верхній шар сорбенту. Для остаточної підготовки патрона Діапак А-3 достатньо зафіксувати шар сорбенту невеликим ватним тампоном.
• 3. Для підготовки патрона Діапак П-3 сорбент промивають послідовно 10 см 3 бензолу, ацетону та екстрагента Апри слабкому вакуумуванні (швидкість скопування не більше 1-2 крапель на секунду), не допускаючи попадання повітря на сорбент. Після заповнення патрона ацетоном дають сорбенту відстоятися, вводять верхній полімерний фільтр, ущільнюють його верхнього шару сорбенту і продовжують промивання. При досягненні екстрагентом Арівня 2-3 см над фільтром промивання припиняють і патрон закупорюють нижньою заглушкою та верхньою кришкою (для зберігання). При випадковому пересиханні патрон промивають екстрагентом А.Перед нанесенням проби заглушки знімають і при слабкому вакуумуванні пропускають залишки водно-ацетонітрильної суміші рівня верхнього фільтра, потім негайно заливають досліджуваний розчин. Регенерацію багаторазового патрона Діапак П-3 проводять за аналогічною схемою, крім вилучення верхнього фільтра.

Концентруючий патрон Діапак С готують до роботи наступним чином:

• 1. Готова поліпропіленова капсула з 1 см 3 сорбенту Діапак С закупорена заглушками. Після зняття заглушок патрон готують до роботи, пропускаючи через нього за допомогою шприца 5 см 3 гексану зі швидкістю скапування 1-2 краплі в секунду.
• 2. Пробу наносять самопливом, використовуючи як лійку порожній поліпропіленовий корпус об'ємом 10 см 3 щільно закріплений у верхньому штуцері капсули Діапаку С.

Підготовка проби до вимірювань

Екстракція гексаном бенз(а)пірена із проби копченого продуктуНаважку 10,0 г проби копченого продукту розтирають у ступці з 30 г сульфату безводного натрію. Суміш кількісно переносять у плоскодонну колбу місткістю 100 см 3 і екстрагують гексаном обсягом 40 см 3 протягом не менше 30 хв при перемішуванні. Первинний екстракт гексан сумарного жиру проби декантують і пропускають через 10 г безводного сульфату натрію в відгінну колбу. Двічі повторюють процедуру екстракції двома обсягами по 20 см 3 гексану і пропускають порції екстракту через осушувач у ту ж відгінну колбу. Гексан упарюють на ротаційному випарнику при температурі не вище 35 °С до зникнення запаху.

Екстракт сумарного жиру розчиняють у 20 см 3 екстрагента,кількісно переносять у мірний циліндр місткістю 50 см 3 і доводять об'єм розчину до 40,0 см 3 тим самим розчинником.

20,0 см 3 отриманого розчину переносять у ділильну вирву місткістю 100 см 3 і проводять переекстракцію БП в ацетонітрил трьома обсягами по 20 см 3 екстрагента Б.Щоразу, домагаючись по можливості повнішого поділу фаз, відбирають нижній шар (ацетонітрильний екстракт БП) і упарюють на ротаційному випарнику при температурі не вище 50 °Сдо обсягу 10-15 см 3 . Кількісно (за допомогою ацетонітрилу) переносять розчин у мірний циліндр місткістю 25 см 3 доводять об'єм до 21,0 см 3 ацетонітрилом, додають 4,0 см 3 бідистильованої води і ретельно перемішують отриманий водно-ацетонітрильний екстракт БП.

Екстракція бенз(а)пірена з проби зерна або ґрунту сумішшю ацетонітрил-вода

Наважку 10-25 г проби переносять у плоскодонну колбу, додають 50-125 см 3 екстрагента А,суворо дотримуючись співвідношення 1:5 навішування продукту обсягу екстрагента, і перемішують протягом 1 години. Фільтрують водно-ацетонітрильний екстракт БПчерез паперовий фільтр на вирві Бюхнера під вакуумом і віджимають осад на фільтрі.

Попереднє очищення та концентрування первинного екстракту зерна або копченого продукту

Пропускають через патрон Діапак А-3 25 см 3 а потім 3 см 3 екстрагента Апри швидкості скапування 2-3 краплі на секунду в приймальну колбу.

Пропускають через підготовлений патрон Діапак П-3 зібраний елюат, а потім 5 см 3 ацетонітрилу при швидкості скапування 1-2 краплі на секунду, відкидаючи змив. Елююють з патрона цільову фракцію, що містить БП, сумішшю бензол-ацетонітрил (1:1) в об'ємі 7 см 3 при швидкості скапування 1-2 краплі на секунду відгінну колбу. Упарюють елюат на ротаційному випарнику при температурі не вище 50 °С, додають у колбу 0,5 см 3 гексану і ретельно струшують на мікрозмішувачі до повного розчинення сухого залишку.

Попереднє очищення та концентрування первинного екстракту ґрунту

Пропускають через патрон Діапак А-3 5,0 см 3 водно-ацетонітрильного екстракту БП,потім 3 см 3 екстрагента Апри швидкості скапування 2-3 краплі на секунду в приймальну колбу. Переносять елюат в мірний циліндр місткістю 25 см 3 ополіскують колбу двома обсягами по 5 см 3 екстрагента Аі доводять об'єм розчину в циліндрі до 20 см 3 .

Пропускають через підготовлений патрон Діапак П-3 5,0 см 3 розведеного елюату, а потім 5 см 3 ацетонітрилу при швидкості скапування 1-2 краплі на секунду, відкидаючи змив. Елююють з патрона цільову фракцію, що містить БП, сумішшю бензол-ацетонітрил (1:1) в об'ємі 7 см 3 при швидкості скапування 1-2 краплі на секунду відгінну колбу. Упарюють елюат на ротаційному випарнику при температурі не вище 50 °С, додають у колбу 0,5 см 3 гексану і ретельно струшують на мікрозмішувачі до повного розчинення сухого залишку.

Тонка очищення екстракту

Наносять на підготовлений патрон Діапак З самопливом 0,5 см 3 розчину проби в гексані, потім колбу обмивають двома порціями по 0,5 см 3 гексану і послідовно наносять їх на патрон, відкидаючи всі змиви. Елююють БП бензолом в об'ємі 2,0 см 3 зі швидкістю скопування 1-2 краплі в секунду у відгінну колбу і упарюють на ротаційному випарнику при температурі не вище 50 °С. Розчиняють сухий залишок екстракту проби БП у суміші ацетонітрил-вода (7:3), обсяги якої вказані в розділах «Умови проведення вимірювання» для кожного варіанта хроматографічної системи (див. нижче).

Градуювання та виконання вимірювань

Градуювання хроматографа

Градуювання хроматографа здійснюють послідовним введенням (в умовах проведення вимірювання БП) номінального обсягу градуювальних розчинів (табл. 2) у порядку зростання їх масових концентрацій. Кожен розчин вводять у хроматограф не менше двох разів. При правильному налаштуванні хроматографічної системи висота піку на хроматограмі градуювального розчину з найменшою концентрацією повинна перевищувати рівень шумів базової лінії не менше ніж у 10 разів.

Після математичної обробки хроматограм фіксують параметри утримування і площі піків і будують градуювальні характеристики (ГХ), що відображають залежність середнього значення площі піку від масової концентрації БП в градуювальному розчині.

Контролюють правильність побудови градуювальної характеристики.

Градуювальну характеристику перебудовують при зміні колонок після проведення ремонтно-профілактичних робіт, при негативних результатах контролю стабільності ГХ (див. нижче).

Визначення бенз(а)пірена

Умови проведення виміру (Варіант 1)

Для аналізу підготовлений екстракт проби БП розчиняють 0,1 см 3 суміші ацетонітрил-вода.

Режими роботи ФМД та УВПА задають з клавіатури ЕОМ відповідно до Посібника користувача (ПАК «МультиХром-Спектр») та контролюють на моніторах у наступному вигляді:

Флуориметричний детектор

• довжина хвилі збудження 296 нм;
• довжина хвилі випромінювання - світлофільтр № 2 (більше 380 нм);
• час виміру 0,2 с.

Автоматичний дозатор

• обсяг регенерації 0,4 см 3;
• обсяг проби 0,04 см 3;
• швидкість потоку 0,15 см 3 /хв;
• швидкість набору 0,3 см 3 /хв;
• час утримання БП 11 хв.
• склад елюентів у судинах та схема складання градієнта ацетонітрилу представлена ​​в табл. 3.

Таблиця 3.Елюенти

Умови проведення вимірювання (Варіант 2)

Для аналізу підготовлений екстракт проби БП розчиняють в 0,5 см 3 суміші ацетонітрил-вода.

• фільтр на лінії збудження – «Х4»;
• фільтр на лінії емісії – «ХЗ»;
• обсяг проби 0,02 см 3;
• чутливість середня;
• згладжування – 4;
• рівень «фону» вибирають за результатами реєстрації пробної хроматограми градуювального розчину №3.

• швидкість потоку 0,2 см 3 /хв;
• елюенти 84;
• час утримання БП близько 12 хв.

Градієнтний режим поділу:

• швидкість потоку 0,25 см 3 /хв;
• елюенти 100в елюенті 70за 20 хв;

Умови проведення вимірювання (Варіант 3)

Для аналізу підготовлений екстракт проби БП розчиняють 0,5 см 3 суміші ацетонітрил-вода.

• довжина хвилі збудження 375 нм;
• довжина хвилі емісії 405 нм;
• швидкість потоку 0,8 см 3 /хв;
• обсяг проби 0,02 см 3;
• постійна часу 1,0 с.

Ізократичний режим поділу:

• елюенти 84;
• час утримання БП близько 12 хв;

Градієнтний режим поділу:

• лінійний градієнт від 30 до 70% елюенти 100в елюенті 70за 20 хв;
• час утримання БП близько 14 хв.

Одержання та обробка хроматограм

Введення в хроматограф розчину екстракту проби здійснюють двічі. Ідентифікацію БП проводять на підставі порівняння параметрів утримування піків на хроматограмах екстракту проби та градуювальних розчинів. Орієнтовні параметри утримування наведено в розділах «Умови проведення вимірювань». Надійної ідентифікації з'єднання, що визначається, відповідає різниця значень параметрів утримування для градуювального розчину і проби, що не перевищує 0,2 хв.

Розведення розчину екстракту

Проводять у тому випадку, якщо масова концентрація визначається БП перевищує його найбільшу масову концентрацію в градуювальних розчинах. Розчин екстракту розбавляють удвічі (ступінь розведення, dil = 2), відбираючи рівні об'єми даного розчину та суміші ацетонітрил-вода (70:30) та змішуючи останні. У тому випадку, якщо одноразове розведення не позбавляє «зашкалювання», процедуру повторюють (ступінь розведення, dil = 4).

Обробка результатів вимірювань

Обчислюють середнє значення площі піку (вихідного сигналу хроматографа) для двох вводів розчину екстракту проби хроматограф. Контролюють збіжність вихідних сигналів (див. нижче).

За градуювальної залежності знаходять значення масової концентрації БП у розчині, що відповідає середньому значенню площі піку.

Масову частку БП (І^), мг/кг, в/-ій пробі (результат визначення) обчислюють за формулою

де Сбп - масова концентрація визначається речовини в розчині екстракту/-ої проби БП, мкг/см 3 (обчислюється за градуйовою залежністю, виходячи із середнього значення площі піку); V p- Об'єм розчину екстракту /-ой проби БП, см 3 ; R- ступінь вилучення БП на стадії пробо-підготовки за табл. 2; М екв- маса частини проби, що відповідає частці водно-ацетонітрильного екстракту БП, використаної для очищення та подальшого хроматографічного визначення - еквівалентна маса проби, що становить 5,0 г (зерно, копчені продукти) або 0,25 г (грунт).

У разі розведення екстракту (див. вище) масову частку БП ( W,-,мг/кг) у /-ому вимірі обчислюють за формулою

де Wj- Значення, отримане за формулою (II. 1), dil - ступінь розведення (див. вище).

Обчислюють середнє для двох проб значення масової частки БП (результат аналізу):

Контролюють збіжність результатів визначення масової частки БП (див. нижче).

Оформлення результатів вимірів

Результат аналізу (вимірювання) масової частки БП в об'єкті, що визначається, представляють у формі

де W -масова частка БП, розрахована за такою формулою (II.3).

У разі, якщо БП не виявлено, результат виміру подають у формі

де П"ДС - допустимий вміст БП за табл. 1.

Контроль похибки МВІ

Контроль збіжності вихідних сигналів хроматографа

Контроль проводять при градуюванні та аналізі кожної проби щодо вихідних сигналів (значень площ піків БП на хроматограмах), отриманих при двох введеннях розчину хроматограф. Результат контролю визнають задовільним, якщо розмах вихідних сигналів, віднесений до середнього арифметичного, не перевищує 8%.

Контроль правильності побудови градуювальної характеристики

Контроль проводять при кожному градуюванні. Результат контролю визнають задовільним при виконанні для кожного "-го градуювального розчину умови

де Sj- середнє значення площі піку БП для у"-го градуювального розчину, у.о.; S)- значення площі піку, що відповідає за градуювальною характеристикою масової концентрації БП в у-му градуювальному розчині, у.о.

Контроль стабільності градуювальної характеристики

Контроль проводять щодня перед початком роботи з аналізованими пробами по контрольному розчину, як якого використовують градуювальний розчин з масовою концентрацією БП, що відповідає його допустимому вмісту в аналізованому об'єкті.

Результат контролю визнають задовільним під час виконання умови

де С кі - значення масової концентрації БП в контрольному розчині, знайдене за градуювальною характеристикою для середнього значення площі піку, мкг/см 3 ; С к - значення масової концентрації БП у контрольному розчині згідно з табл. 2.

Контроль збіжності результатів визначення

Контроль проводять при кожному аналізі (вимірюванні). Результат контролю визнають задовільним, якщо розмах результатів ухвал, віднесений до середнього арифметичного (результату аналізу), не перевищує 10%.

Контроль похибки методом добавок

Контроль проводять:

• а) перед початком застосування цієї МВІ – в обов'язковому порядку;
• б) у разі сумнівних результатів визначення масової частки БП;
• в) відповідно до планів внутрішньолабораторного контролю;
• г) на вимогу організацій, що контролюють діяльність лабораторії.

Добавка формується на основі градуювального розчину. Величина добавки (D,мг/кг) вибирається такою, щоб масова частка БП у пробі збільшилася у 1,5-2,5 рази. Розрахунок проводять за формулою

де C D- масова концентрація БП у градуювальному розчині, мкг/см 3 ; Vo- обсяг градуювального розчину БП, що вводиться в пробу, см 3; М жв- еквівалентна маса проби, взятої на аналіз;

Добавка вводиться в первинний екстракт проби зерна або ґрунту у вигляді градуювального розчину, приготовленого відповідно до табл. 2. У первинний екстракт копченого продукту добавка вводиться у вигляді розчину аналогічної концентрації гексані. Для цього ДСО складу БП в гексані (див. вище) розбавляють (з урахуванням поправки на атестоване значення концентрації) відповідно до процедури приготування градуювальних розчинів (див. вище), використовуючи як розчинник гексан і отримуючи розчин необхідної концентрації. При використанні ДСО складу БП в ацетонітрилі після упарювання розчинника сухий залишок перерозчиняють гексаном і розбавляють гексаном, як описано вище.

Аналіз двох проб з природним вмістом БП та двох проб з добавкою БП проводять в однакових умовах (один прилад, одна градуювальна характеристика, один оператор). Результат контролю визнають задовільним під час виконання умови

де W D- масова частка БП у пробах із добавкою, мг/кг; W- масова частка БП у пробах без добавки, мг/кг ( W Dі W-середні значення масової частки для двох проб за позитивних результатів контролю збіжності).

Ілюстрацією застосування цієї методики у практичній екоаналітиці можуть служити хроматограма та градуювальний графік для визначення бенз(а)пірену в харчових продуктах (рис. 11.15 та 11.16).

Результати контролю похибки визначення бенз(а)пірена в об'єктах методом добавок з флуориметричним детектуванням 375 Ех/405 Ет (Варіант 3).

Рівень добавки відповідає 0,5 допустимого вмісту бензапірену (0,0005 мг/кг – зерно та копчені продукти, 0,01 мг/кг – ґрунт).

Рис. 11.15.

Градуювання для компонента: БаП Коефіцієнт кореляції: 0,999667 Відгук: Площа

Опорний канал 365 Ех/405 Em

Формула Y = Ki X

Значення 100 ( W D - W - D)/Dскладають 10 та 16% для зразків 1 та 2 відповідно. З'єднання, що визначається, у вихідному зразку пшеничного борошна присутній в кількості 0,00009 кг/кг.

Зразок 1 – 0,00064 мг/кг Зразок 2 – 0,00067 мг/кг

• У загальному випадку градуювальна характеристика має види S = ​​АС + В де S - площа піку, у.о.; З - масова концентрація забруднювача, мкг/см3; А і В – коефіцієнти.