Osvedčenie č. 30-08 zo dňa 03.04.2008
FR.1.31.2008.01033

1. Predmety výskumu

Tento postup merania sa vzťahuje na údené mäso, údené ryby a mastné výrobky a stanovuje stanovenie hmotnostnej koncentrácie benzo(a)pyrénu pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s fluorometrickou detekciou.

2. Rozsah merania

MPC benzo (a) pyrénu v tučnom, údenom mäse a údených rybích výrobkoch je 1 μg / kg.

Metóda poskytuje výsledky meraní hmotnostnej koncentrácie benzo(a)pyrénu v rozsahoch uvedených v tabuľke 1.

Tabuľka 1. Rozsahy merania hmotnostnej koncentrácie benzo(a)pyrénu

Typ produktu	Hmotnostný rozsah koncentrácia, μg / kg	MPC, μg / kg
tučné jedlá	0,5 – 2,0	1,0
údené mäsové výrobky	0,5 – 2,0	1,0
údené rybie produkty	0,5 – 2,0	1,0

3. Príprava vzorky

Odber vzoriek, konzervácia a skladovanie vzoriek produktov sa vykonáva v súlade s GOST 7631, GOST 9792, TU a ďalšími regulačnými dokumentmi upravujúcimi odber vzoriek pre špecifické typy produktov.

Príprava vzorky pozostáva z fáz odberu vzoriek (vzorka sa predchladí na teplotu mínus 12-18 °C počas 30 minút), mletia, homogenizácie s bezvodým síranom sodným, extrakcie zhomogenizovanej vzorky hexánom v banke pomocou ultrazvukový kúpeľ, samovoľné vyzrážanie tuhej zrazeniny (v 1-2 min.), odtučnenie extraktu v mrazničke (do valca sa vloží vzorka silikagélu, naleje sa extrakt, obsah valca sa vloží do v mrazničke), supernatantová hexánová vrstva sa čistí extrakciou bez zadržania tuhou fázou (na patrónach Strata Silica Si-1) *, vyfúknutím eluátu v prúde vzduchu alebo inertného plynu.

* Poznámka. Ak je koncentrácia tukov vo východiskovom analyzovanom produkte nižšia ako 5 %, musí sa do pôvodného extraktu vzorky po zmrazení pridať malé množstvo elučného činidla – etylacetátu (0,1 ml až 6 ml čisteného extraktu).

4. Uskutočnenie chromatografickej analýzy

4.1. Zariadenia a podmienky na HPLC analýzu kalibračných roztokov benzo(a)pyrénu, pripravenej vzorky produktu.

Na chromatografickú analýzu benzo(a)pyrénu je potrebné použiť izokratický vysokoúčinný kvapalinový chromatografický systém s fluorometrickou detekciou.

Na analýzu sa predbežne pripravia kalibračné roztoky z GSO roztoku benz(a)pyrénu v hexáne alebo z GSO roztoku benz(a)pyrénu v acetonitrile (rozpúšťadlo sa odfúkne, štandardná vzorka sa znovu rozpustí v hexáne); vykonať prípravu vzorky; pripraviť zariadenie na prevádzku.

Vybavenie:

kvapalinový chromatograf "Stayer" s fluorometrickým detektorom;

osobný počítač s nainštalovaným softvérom „MultiChrom pre Windows XP“ verzie 1.5 alebo 2x.

izokratický režim;

kolóna: Luna C18 (2) 150 x 3,0 mm 3 um (Phenomenex, USA);

ochranná kolóna: C18 4x3,0 mm (Phenomenex, USA);

mobilná fáza: acetonitril/vodný roztok (75:25);

prietoková rýchlosť: 0,3 ml/min;

objem slučky: 10 μl;

teplota: 50 °C;

rozsah RFU: 0,01;

detekcia: fluorometrická (Aex: 365 ± 2 nm; Áem: 400-460 nm).

Kalibrácia sa vykonáva pomocou kalibračných roztokov (v celom rozsahu stanovených koncentrácií) najmenej raz za dva týždne, ako aj pri použití novej šarže činidiel, výmene kolón a po oprave chromatografu.

4.2. Stanovenie kvantitatívneho obsahu benzo(a)pyrénu vo vzorke produktu.

Na stanovenie kvantitatívneho obsahu zložky vzorky produktu (benzo(a)pyrén) sa vykoná chromatografická analýza jedného z kalibračných roztokov, po ktorej nasleduje chromatografická analýza pripravenej vzorky. Pre spoľahlivosť meraní sa chromatografická analýza kalibračného roztoku aj pripravenej vzorky vykonáva aspoň 2-krát za sebou.

Pomocou nainštalovaného softvéru - "MultiChrome for Windows XP" v správe alebo nad vrcholom (v závislosti od nastavenia možností "VIEW") na konci merania sa automaticky určí výsledok vo forme koncentrácie vo vzorke. zavedené do chromatografu (ale nie do počiatočnej vzorky odobratej na výskum!).

Na získanie výsledku je potrebné vykonať aspoň dve paralelné merania (získať dva chromatogramy). Aritmetický priemer obsahu benzo (a) pyrénu v koncentráte analyzovanej vzorky C xp, μg / l (vypočítaný z dvoch hodnôt hmotnostnej koncentrácie benzo (a) pyrénu v koncentráte analyzovanej vzorky C 1 a C 2) sa berie ako výsledok merania.
Hmotnostný podiel benzo(a)pyrénu v analyzovanej vzorke (v pôvodnej vzorke) X, μg / kg sa vypočíta podľa vzorca:

kde:
C xp - priemerná hodnota koncentrácie benzo(a)pyrénu získaná ako výsledok chromatografie v dvoch paralelných meraniach [ng/ml];
V 1 - objem pôvodného extraktu, ktorý sa v skutočnosti rovná objemu hexánu použitého na primárnu extrakciu (50 ml);
V 2 - objem extraktu (časť originálu) odobratého na zmrazenie (30 ml);
V 3 - objem extraktu (časť extraktu po zmrazení) odobratý pre SPE (6 ml) [ml];
V 5 - objem konečného extraktu, ktorého časť sa zavedie do chromatografu (asi 3 ml) [ml];
K odber vzoriek - faktor odberu vzoriek, ktorý zohľadňuje podiel hmotnosti vzorky produktu (zmiešanej so síranom sodným) odobratej na extrakciu z celkovej hmotnosti vzorky odobratej na analýzu. Vo všetkých prípadoch sa rovná 0,736;
K zmrazenie Je stratový faktor benzo(a)pyrénu počas mrazenia. Pre všetky kategórie študovaných produktov je tento koeficient rovnaký a rovný 0,95;
K ext. 1 - koeficient primárnej extrakcie kvapaliny hexánom. Je rovnaký pre všetky kategórie skúmaných produktov a rovná sa 0,95;
K TFExtr.2- koeficient extrakcie benzo (a) pyrénu tuhou fázou je 0,95;
m pr. - pôda alebo pôda odobratá na analýzu [g].

strana 1

strana 2

str. 3

str. 4

str. 5

strana 6

strana 7

strana 8

strana 9

str. 10

strana 11

str. 12

str. 13

str. 14

str. 15

strana 16

str. 17

str. 18

str. 19

GOST 24104.

Rotačný odparovač IR-1M.

GOST 25336.

Voda do kúpeľa.

Magnetické miešadlo typu MM-ZM s elektrickým ohrevom.

Ultrafialový iluminátor typu "Chromatoscope" so spektrálnym rozsahom 250 - 700 nm a výbojka BUV-15 ako zdroj UV žiarenia.

Sklenená chromatografická komora 40 x 40 x 40 cm.

Sklenené platne pre tenkovrstvovú chromatografiu 5 x 20 a 20 x 20 cm.

Sklenená chromatografická kolóna s dĺžkou 500 mm a priemerom 20 mm s vytiahnutým koncom na dne a zásobníkom s objemom 50 - 60 cm 3 PSh 14/23.

Chladnička ХПТ-2-400-29 / 32 ХС alebo ХШ-1-400-29 / 32 ХС v súlade s GOST 25336.

Spolu s typom AIO-14 / 23-50 TS alebo AIO-14 / 23-14 / 23-65 TS v súlade s GOST 25336.

Meracie pravítko s delením 0,1 cm v súlade s GOST 427.

Deflegmátor 250-19 / 26-29 / 32 ТС alebo 300-19 / 26-29 / 32 podľa GOST 25336.

Tryska P-1-19 / 26-14 / 23-14 / 23 ТС alebo Н-2-19 / 26-14 / 23 ТС v súlade s GOST 25336.

GOST 25336.

GOST 25336. Meracie valce 1-100, 1-250 alebo 3-100, 3-250 v súlade s GOST 25336.

Chemické sklo V-1-100 alebo V-1-150 v súlade s GOST 25336.

Banky К-1-100-29 / 32 ТХС, К-1-25Р-29/32 ТХС, К-1-500-29 / 32 ТХС alebo П-1-500-29 / 32 ТХС v súlade s GOST 6.3

Buchnerov lievik 1 alebo 2 alebo 3 v súlade s GOST 9147.

Váhy (navažovacie fľaše) SV-14/8 alebo SV-19/9, alebo SV-24/10, alebo SV-34/12 v súlade s GOST 25336.

Mikrostriekačky typu MSh-10, sklenené kapiláry.

Univerzálny indikátorový papierik.

Laboratórny filtračný papier v súlade s GOST 12026.

Skalpel alebo tenká špachtľa.

Rektifikovaný etylalkohol podľa GOST R 51652 alebo technický rektifikovaný etylalkohol podľa GOST 18300.

Acetonitril podľa normatívneho dokumentu.

Mikrokryštalická prášková celulóza podľa normatívneho dokumentu.

GOST R 51650-2000

Benz (c) chryzén, obsah hlavnej látky nie je nižší ako 98 %.

Sephadex LH-20.

Silikagél značky ASKG podľa normatívneho dokumentu.

Je povolené používať iné meracie prístroje s metrologickými charakteristikami a zariadeniami s technickými charakteristikami, ako aj reagencie a materiály kvality, ktorá nie je nižšia ako vyššie uvedené.

5.2 Príprava testu

5.2.1 Príprava rozpúšťadla

Rozpúšťadlá (n-hexán, etylalkohol, acetón, benzén) sa destilujú bežným spôsobom so spätným chladičom.

Dimetylformamid sa destiluje pridaním 120 cm 3 benzénu a 36 cm 3 vody na 1 dm 3 rozpúšťadla do destilačnej banky.

5.2.2 Príprava acetylovanej celulózy

(50,0 ± 2,0) g mikrokryštalickej celulózy sa vloží do banky s plochým dnom s objemom 500 cm3, pripraví sa zmes 150 cm3 benzénu alebo toluénu, 70 cm3 anhydridu kyseliny octovej a 0,3 cm3 kyseliny sírovej. v samostatnej banke. Reakčná zmes sa mieša 6 - 8 hodín magnetickým miešadlom, ďalších 18 hodín sa nechá bez miešania, potom sa kvapalná fáza dekantuje a zvyšok sa naleje do 300 cm3 etylalkoholu, premieša sa a nechá sa v alkohole 24 hodín, potom sa celulóza prefiltruje na Buchnerovom lieviku, premyje sa 100 cm3 etylalkoholu a destilovanej vody, kým nie je premývacia voda neutrálna (podľa indikátorového papierika).

Potom skontrolujte chromatografickú aktivitu acetylovanej celulózy. Na tento účel sa 3 až 4 hodiny pred analýzou pripraví zmes etylalkoholu, acetónu a vody v objemovom pomere 60:25:15 a naleje sa do chromatografickej komory vystlanej pásikmi filtračného papiera. Výška vrstvy rozpúšťadla by mala byť 1,5 - 2 cm 1,5 g acetylovanej celulózy sa suspenduje v 7 cm 3 etylalkoholu a suspenzia sa naleje do rovnomernej vrstvy na sklenenú platňu 5 x 20 cm, rozpúšťadlo sa nechá sa úplne odparí na vzduchu a nanesie sa na platňu mikrostriekačkou alebo sklom s kapilárou do 5 μl roztoku benz(a)pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 1 μg/cm3. Platňa sa umiestni do chromatografickej komory a ponechá sa v komore, kým hladina rozpúšťadla nestúpne aspoň 100 mm od štartovacej čiary. Na konci chromatografie sa platňa vyberie, vysuší na vzduchu a pod ultrafialovou lampou sa zaznamená modrá fluorescenčná škvrna benzo(a)pyrénu. Zmerajte vzdialenosť od štartovacej čiary po čelo rozpúšťadla a do stredu benz(a)pyrénovej škvrny; vypočítajte hodnotu Rj, ktorá odhaduje rýchlosť pohybu benzo (a) pyrénu pozdĺž dosky, podľa vzorca:

kde X BP je vzdialenosť od štartovacej čiary po stred benzo (a) pyrénovej škvrny, mm;

L je vzdialenosť od štartovacej čiary po čelo rozpúšťadla, mm.

Hodnota Rj benzo(a)pyrénu by mala byť 0,1.

Na prípravu pracovnej dosky sa 5 g acetylovanej celulózy suspenduje v 20 cm3 etylalkoholu a naleje sa do rovnomernej vrstvy na dosku 20 x 20 cm.

5.2.3 Príprava štandardných roztokov benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu

Navážte (10,0 + 0,2) mg benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu do odvažovačiek (navažovačiek). Odvážené dávky sa kvantitatívne prenesú do odmerných baniek s objemom 100 cm 3: benz (a) pyrén-benzén, benz (c) chryzén-acetonitril, potom sa objem roztoku benz (a) pyrénu upraví po značku pomocou benzén, objem roztoku benz(c)chryzén-acetonitrilu. Výsledné roztoky majú hmotnostnú koncentráciu 100 μg / cm3. Roztoky sa uchovávajú na chladnom a tmavom mieste nie dlhšie ako tri mesiace.

5.2.4 Príprava pracovných roztokov benz (a) pyrénu a benz (c) chryzénu

Pracovné roztoky sa pripravujú riedením štandardných roztokov pomocou pipiet s objemom 1, 5 a 10 cm 3 a odmerných baniek s objemom 100 cm 3, objem roztoku sa doplní po značku príslušným rozpúšťadlom, premieša sa a uskladní na chladnom tmavom mieste nie dlhšie ako jeden mesiac.

Príprava roztoku benz (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 1,0 μg / cm 3 (na stanovenie spektrofluorimetriou): 1,0 cm 3 sa odoberie zo štandardného roztoku a prenesie sa do odmernej banky s objemom 100 cm 3; objem roztoku sa upraví po značku benzénom.

Príprava roztoku benz (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 0,25 : 1,0 a 5,0 μg / cm 3 (na stanovenie vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou): 0,25 sa odoberie zo štandardného roztoku; 1,0; 5,0 cm3 a prenesie sa do odmerných baniek s objemom 100 cm3; objem roztokov sa doplní po značku acetonitrilom.

Príprava benzu (c) roztoky chryzénu s hmotnostnou koncentráciou 0,5 a 10 μg/cm3: Zo štandardného roztoku sa odoberie 0,5 a 10 cm3 a prenesie sa do odmerných baniek s objemom 100 cm3; objem každého roztoku sa doplní po značku acetonitrilom.

5.2.5 Príprava kalibračných roztokov

Na prípravu kalibračných roztokov zmesi benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu sa použijú objemy štandardného roztoku benzo (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 100 μg / cm 3 a pracovného roztoku benzu (c ) hmotnostná koncentrácia chryzénu 10 μg / cm 3, doplňte objem po značku acetonitrilom. Výsledné roztoky sa zmiešajú a skladujú na tmavom a chladnom mieste nie dlhšie ako jeden mesiac.

tabuľka 2

Riešenie Objem počiatočného roztoku, cm 3 Hmotnostná koncentrácia v kalibračnom roztoku, μg / cm 3 Hmotnostná koncentrácia benz (a) pyrénu 100 μg / cm3 Benz (c) hmotnostná koncentrácia chryzénu 10 μg/cm3 Benz (a) pyrén Benz (v) chrysena

5.3 Postup skúšky

5.3.1 Izolácia benzo(a)pyrénu z produktu

Do banky s guľatým dnom alebo banky s plochým dnom s objemom 100 cm 3 vložte vzorku produktu s hmotnosťou 10 g, pridajte roztok pozostávajúci zo 4 g hydroxidu draselného v 50 cm 3 92 % etylalkoholu. Obsah banky sa premieša pretrepaním. Banka sa napojí na spätný chladič a zahrieva sa vo vodnom kúpeli alebo na magnetickom miešadle za varu reakčnej zmesi 3 hodiny, potom sa do banky cez chladič pridá 100 cm3 destilovanej vody. Reakčná hmota sa ochladí na teplotu miestnosti. Po ochladení sa reakčná hmota prenesie do oddeľovacieho lievika s objemom 500 cm3. Ak po hydrolýze zostane v reakčnej hmote pevný zvyšok, oddelí sa na Buchnerovom lieviku a zvyšok na filtri sa premyje 30 cm3 horúceho etylalkoholu. Kvapalná fáza reakčnej hmoty sa použije na extrakciu. Pridajte 30 cm 3 N hexánu do oddeľovacieho lievika. Obsah lievika sa pretrepe a nechá sa oddeliť tekutiny. Ak sa vytvorí emulzia, k zmesi sa v deliacom lieviku pridá 20 cm3 etylalkoholu. Po stratifikácii sa spodná vodno-alkoholická fáza naleje do banky a hexánový extrakt sa naleje do ďalšieho oddeľovacieho lievika. Toto spracovanie reakčnej hmoty sa uskutoční ešte dvakrát s použitím 30 cm3 n-hexánu na extrakciu a etylalkoholu na delamináciu emulzie v 20 cm3 častiach.

Na konci extrakcie sa spojený hexánový extrakt premyje v oddeľovacom lieviku destilovanou vodou trikrát po 30 cm3, extrakt sa prenesie do banky s guľatým dnom s objemom 100 cm3, prefiltruje sa cez vrstvu bezvodého síranu sodného na lieviku s poréznym filtrom. Roztok sa odparí na rotačnej odparke na objem 50 cm3 pri teplote vodného kúpeľa nie vyššej ako 60 °C.

Odtiahnutý extrakt sa prenesie do oddeľovacieho lievika s objemom 500 cm3 a pridá sa k nemu 50 cm3 zmesi dimetylformamidu a vody v objemovom pomere 9:1. Zmes sa intenzívne pretrepáva 1 min, po oddelení fáz sa spodná naleje do banky s plochým dnom s objemom 200 cm3 a z hornej hexánovej vrstvy sa odoberie 50 cm3 zmesi dimetylformamidu a vody. znova extrahované. Hexánová vrstva sa odstráni, dimetylformamidový extrakt spojený v banke s plochým dnom sa prenesie do oddeľovacieho lievika, pridá sa 100 cm3 destilovanej vody a z vodnej fázy sa uskutoční extrakcia hexánom trikrát po 50 cm3. Vodná fáza sa vyhodí a hexánový extrakt sa premyje vodou trikrát 30 cm3, prenesie sa do banky s plochým dnom, pridá sa 10 g bezvodého síranu sodného a nechá sa stáť jednu hodinu, n hexán sa odparí na rotačnej odparku na objem 1,5-2,0 cm3, zvyšné rozpúšťadlo sa odstráni

GOST R 51650-2000

prúdom vzduchu cez vákuovú trubicu napojenú na vodnú vývevu sa zvyšok v banke rozpustí v 0,5 cm3 etylalkoholu.

Do pohára s objemom 100 cm 3 navážte (2,5 ± 0,2) g Sephadexu LH-20, pridajte 20 cm 3 etylalkoholu a nechajte 3 - 4 hodiny napučať.kolóna, nechajte rozpúšťadlo odtiecť tak, aby alkoholová vrstva nad vrstvou sorbentu zostáva aspoň 2 mm. Zvyšok extraktu z banky sa napipetuje do pripravenej kolóny, pričom sa z banky vymyje trikrát etylalkoholom v dávkach po 0,5 cm3. Elúcia z kolóny polycyklických aromatických uhľovodíkov vrátane benz(a)pyrénu sa uskutočňuje 40 cm 3 etylalkoholu, prvá frakcia s objemom 12 cm 3 sa vyhodí, druhá frakcia s objemom 25 cm 3 sa zhromažďuje. Rýchlosť elúcie rozpúšťadla 0,5 cm3/min sa dosiahne vytvorením mierneho pretlaku prúdom vzduchu alebo dusíka cez dýzu spojenú s dúchadlom alebo plynovou fľašou. Plyn by sa mal privádzať cez sklenenú trubicu naplnenú silikagélom.

Kolóna Sephadex LH-20 je opakovane použiteľná. Na tento účel, bez toho, aby sa nechal sorbent po frakcionácii vyschnúť, sa kolóna premyje 25 cm3 etylalkoholu a aplikuje sa ďalšia vzorka.

Roztok druhej frakcie sa prenesie do hruškovitej banky s objemom 50 cm3, rozpúšťadlo sa odparí na objem 0,5 - 1,0 cm3, jeho zvyšok sa odstráni v prúde vzduchu alebo dusíka.

Výsledná frakcia obsahujúca benzo(a)pyrén sa potom analyzuje pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie alebo spektrofluorimetrickej metódy.

Súčasne sa vykonáva kontrolný experiment, pri ktorom sa uskutočňujú všetky stupne analýzy s použitím činidiel podľa metodiky, ale bez vzorky produktu.

5.3.2 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou

5.3.2.1 Chromatografické podmienky

Chromatografické podmienky sa vyberajú v závislosti od typu použitého kvapalinového chromatografu a chromatografickej kolóny.

Ako príklad možno uviesť nasledujúce podmienky pre chromatografické stanovenie benzo(a)pyrénu.

Kvapalinový chromatograf "АИех-334" s fluorescenčným detektorom "Kratos FS-970".

Kolóna Supelcosil LC-PAM so zrnitosťou 5 mikrónov, dĺžka 150 mm, priemer 4,6 mm.

Fluorometrický detektor: excitačná vlnová dĺžka 300 nm, emisný filter 418 nm.

Mobilná fáza: acetonitril a voda v objemovom pomere 8:2.

Rýchlosť elúcie je 2,0 cm3/min.

Objem vstreknutej vzorky je 20 μl.

Citlivosť zosilňovača sa volí tak, aby intenzita signálov benzo (a) pyrénu a vnútorného štandardu, benzo (c) chryzénu, nepresiahla 95 % stupnice.

čas analýzy - 15 min; retenčný čas benz (a) pyrénu - 5 min, benz (c) chryzénu - 13 min.

Analyzované roztoky sa dvakrát chromatografujú za rovnakých podmienok. Plochy píkov sa merajú pomocou integrátora alebo manuálne ako súčin výšky píku a šírky píku v polovičnej výške.

Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu sa vykonáva metódou vnútorného štandardu alebo metódou prídavkov.

5.3.2.2 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu v roztoku (extrakte) získanom podľa 5.3.1 metódou vnútorného štandardu

Pri použití tejto metódy kvantitatívneho hodnotenia sa chromatograf predkalibruje pomocou kalibračných roztokov pripravených podľa 5.2.5.

Za podmienok špecifikovaných v 5.3.2.1 zaznamenajte tri chromatogramy pre každý z pripravených roztokov a zmerajte plochy píkov benzo(a)pyrénu a benzo(c)chryzénu. Určte aritmetický priemer plochy píkov benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu vypočítaný z troch chromatogramov.

Kalibračný koeficient K sa vypočíta podľa vzorca

kde a a 2 sú hmotnosti benz (a) pyrénu (/ l]) a benz (c) chryzénu (m 2) zavedených do chromatografu, μg; 5) a ^ 2 sú plochy píkov benzo (a) pyrénu (.9]) a benzo (c) chryzénu (A^), cm3.

Kalibračný koeficient K sa vypočíta pre každý roztok.

Jeho hodnoty by sa nemali líšiť od aritmetického priemeru kalibračného koeficientu zo všetkých výsledkov o viac ako 10%.

Pri vlnovej dĺžke excitačného svetla 300 nm a emisnom filtri 418 nm je hodnota kalibračného faktora 9,5.

Pred začatím analýzy v štádiu prípravy vzoriek na alkalickú hydrolýzu sa do vzorky produktu a kontrolnej vzorky pridá 50 μl roztoku benzo (c) chryzénu s hmotnostnou koncentráciou 0,5 μg / cm 3 . Obidve vzorky prejdú všetkými skúšobnými krokmi špecifikovanými v 5.3.1. Suchý zvyšok sa rozpustí v 200 ul acetonitrilu.

Za podmienok uvedených v 5.3.2.1 zaznamenajte chromatogramy roztoku benzo (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 100 μg / cm 3 a roztoku benz (c) chryzénu s hmotnostnou koncentráciou 100 μg / cm 3 všimnite si čas uvoľňovania benzo (a) pyrénu a benz (c) chryzény. Potom sa zaznamenajú chromatogramy kontrolnej experimentálnej vzorky s prídavkom benzo(c)chryzénu a vzorky produktu s rovnakým prídavkom benzo(c)chryzénu. Zmerajte plochy píkov benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu na chromatogramoch vzorky produktu a kontrolnej vzorky.

Pre každú vzorku sa zaznamenajú dva chromatogramy. Aritmetický priemer plôch píkov benzo (a) pyrénu a benzo (c) chryzénu sa vypočíta z dvoch chromatogramov.

Na základe získaných údajov sa vo vzorke produktu m \ a vzorke kontrolného pokusu m 2 stanoví hmotnosť benzo (a) pyrénu, μg.

„72 je hmotnosť benzo (a) pyrénu v kontrolnej vzorke, μg; t st je hmotnosť benzo (c) chryzénu zavedeného do vzorky produktu a kontrolnej vzorky, μg;

S "] a S 2 - plochy píkov benzo (a) pyrénu na chromatogramoch vzorky produktu (.S"]) a kontrolnej vzorky (.S /), cm 2;

L /, L / - plochy píkov benzo (s) chryzénu na chromatogramoch vzorky produktu (.SS) a vzorky kontrolného experimentu (L /), cm 2;

К - kalibračný koeficient stanovený v súlade s 5.3.2.2.

5.3.2.3 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu v roztoku (extrakte) získanom podľa 5.3.1 metódou pridávania

Na kvantitatívne hodnotenie pri použití adičnej metódy sa vzorka kontrolného experimentu analyzuje súčasne so vzorkou produktu. Frakcie izolované zo vzoriek produktu a kontrolný experiment podľa 5.3.1 sa rozpustia v 400 ul acetonitrilu. Výsledné roztoky sa rozdelia na dve časti, pričom menšia časť (40 μl) sa odoberie do skúmavky alebo banky v tvare hrušky.

Zaznamenajú sa chromatogramy vzorky produktu, kontrolnej vzorky a chromatogram roztoku benz(a)pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 0,25 μg/cm3. Zaznamenáva sa čas uvoľnenia benzo(a)pyrénu.

Do zvyšných častí vzorky produktu a kontrolného experimentu (360 μl) pridajte 10 - 20 μl roztoku benzo(a)pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 5 μg / cm3. Výsledné roztoky sa znovu zavedú do chromatografu.

Všetky chromatogramy sa zaznamenávajú dvakrát. Zmerajte plochy píkov benzo(a)pyrénu. Aritmetický priemer plochy píku benzo(a)pyrénu sa vypočíta z dvoch chromatogramov.

Na základe získaných údajov určte hmotnosť benzo (a) pyrénu, μg, vo vzorke produktu / 77] a vo vzorke kontrolného experimentu t 2:

t op ■ S 1. _ t až ■ S 3 (9)

S 2 - 0,95) '2 5 4 - 0,95 3'

kde / 77 op a / 77 k je hmotnosť benzo (a) pyrénu pridaného do časti extraktu zo vzorky produktu (t op) a kontrolnej vzorky (/%), μg;

S "] a S 2 sú plochy píkov benzo (a) pyrénu na chromatogramoch vzorky produktu (.S"]) a vzorky produktu s prídavkom benzo (a) pyrénu (L /), cm 2;

L / i S) - plocha píkov benz (a) pyrénu na chromatogramoch vzorky kontrolného experimentu (L /) a vzorky kontrolného experimentu s prídavkom benz (a) pyrénu ( L/), cm2;

0,9 je podiel vzorky, do ktorej sa pridáva benzo(a)pyrén.

5.3.3 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu spektrofluorimetricky pri izbovej teplote

Pri stanovení obsahu benzo (a) pyrénu spektrofluorimetriou sa súčasne so vzorkou produktu analyzuje kontrolná vzorka, do ktorej sa pridá 50 μl roztoku benzo (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 1 μg / cm 3 .

Frakcie získané podľa 5.3.1, obsahujúce benzo(a)pyrén, zo vzorky produktu a vzorky kontrolného experimentu s prídavkom, sa rozpustia v 0,5 cm3 benzénu a potom sa podrobia dodatočnému čisteniu v riedkej vrstva acetylovanej celulózy.

Na tento účel sa doštička s rozmermi 20 x 20 cm, pripravená tak, ako je uvedené v 5.2.2, rozdelí na dve polia: bočné - 1,5 - 2 cm široké a hlavné, pričom sa pozdĺž vrstvy sorbentu pretiahne deliaci pásik skalpelom alebo tenkým špachtľa. Na hlavné pole v súvislom páse, 2 cm od spodného okraja platne a 1 cm od bočných okrajov, naneste roztok frakcie izolovanej v 5.3.1. Roztok sa aplikuje pomocou tenko ťahanej kapiláry alebo mikrostriekačky, veľkosť škvŕn by nemala presiahnuť 5 mm. Pre kvantitatívny prenos sa látka dvakrát zmyje zo stien banky malým množstvom benzénu (0,4 - 0,6 cm 3). Na štartovaciu čiaru bočného poľa sa v bode aplikuje 5 μl roztoku benzo (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 1 μg / cm 3 . Po úplnom odparení rozpúšťadla sa platňa umiestni do vopred nasýtenej chromatografickej komory pod uhlom 70 ° - 85 ° a elúcia sa uskutoční zmesou etylalkoholu, acetónu a vody v pomere 60:25. :15. Keď predná strana rozpúšťadla dosiahne 2 cm od horného okraja platne, vyberie sa z komory, vysuší sa na vzduchu a pod ultrafialovou lampou sa vyvolá chromatografická zóna benzo(a)pyrénu. Sorbent z benz(a)pyrénovej zóny z hlavného poľa sa zoškrabne z platne skalpelom alebo tenkou špachtľou a prenesie sa na sklenený filter, z ktorého sa látka v niekoľkých krokoch eluuje 50 cm 3 benzénu do baniek so kapacita 100 cm3, potom sa rozpúšťadlo odparí na malý objem, zvyšok rozpúšťadla sa odstráni prúdom vzduchu a do banky sa pridá 1 cm3 benzénu.

Fluorescenčné spektrá vzorky produktu a kontrolnej vzorky s prídavkom benzo(a)pyrénu sa zaznamenávajú na spektrofluorometri pri vlnovej dĺžke excitačného svetla 386 nm v rozsahu 400 - 440 nm pri rýchlosti skenovania 60 nm/min.

Spektrá roztokov sa zaznamenávajú v jednom amplifikačnom režime s nastavením štrbiny a zosilnenia v roztoku kontrolnej vzorky tak, aby signál benzo(a)pyrénu pri 406 nm bol 0,4 - 0,6 stupnice prístroja. Pre každý roztok sa spektrum zaznamená dvakrát, aby sa dosiahla dobrá reprodukovateľnosť. Na získaných spektrogramoch pri maxime pri 406 nm zmerajte v milimetroch výšku spektrálnej čiary benzo(a)pyrénu pre vzorku produktu a vzorku z kontrolného experimentu. Vypočítajte priemernú hodnotu výšok benzo (a) pyrénu z údajov dvoch spektrogramov. Pri vysokých hladinách benzo(a)pyrénu v produkte sa vzorky zriedia benzénom a spektrum sa znovu zaznamená v rovnakom amplifikačnom režime ako pri kontrolnej vzorke.

Vykonajú sa dve paralelné stanovenia.

5.4 Vyjadrenie výsledkov

5.4.1 Hmotnostný podiel benzo (a) pyrénu v produkte X \,% alebo X 2, mg / kg, pri použití metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, sa vypočíta podľa vzorcov:

(t 1 - t 2) ■ 100 (t g - t 2) t ■ 1000 1000 “t 10

kde mi je hmotnosť benzo(a)pyrénu vo vzorke produktu, μg;

m2 — hmotnosť benzo (a) pyrénu v kontrolnej vzorke, μg; t je hmotnosť produktu odobratého na analýzu, g.

5.4.2 Hmotnostný podiel benzo (a) pyrénu v produkte A), %, alebo X 2, mg/kg, pri použití spektrofluorimetrickej metódy, sa vypočíta podľa vzorcov:

S st NU-100 s ST // V t ■ 1000 ■ 1000 ■

kde c st je hmotnostná koncentrácia benzo (a) pyrénu v pracovnom roztoku pripravenom podľa 5.2.4 a pridanom ku kontrolnej experimentálnej vzorke, μg / cm 3;

výška spektrálnej čiary benzo(a)pyrénu na spektrograme vzorky produktu, mm; výška spektrálnej čiary benzo (a) pyrénu na spektrograme kontrolnej experimentálnej vzorky, mm;

V je objem pracovného roztoku benzo (a) pyrénu pridaného ku kontrolnej vzorke, cm 3; t je hmotnosť vzorky výrobku odobratej na testovanie, g.

Ako konečný výsledok testu sa berie aritmetický priemer dvoch paralelných stanovení s rovnakým počtom platných číslic.

Ak rozdiel medzi výsledkami paralelných stanovení nepresiahne \ X-y - YG 2 |<

< 0,01 dX, где, Х 2 и X- результаты параллельных определений и их среднее арифметическое, а d - норматив контроля сходимости, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива d приведено в таблице 3.

Na základe získaného výsledku analýzy X a hodnoty relatívnej chyby q uvedenej v tabuľke 3 vypočítajte absolútnu chybu A = 0, (ШХ

Výsledok analýzy je prezentovaný ako (X ± A), mg/kg alebo % pri P = 0,95.

5.5 Kontrola presnosti výsledkov analýzy

5.5.1 Opakovateľnosť paralelných stanovení sa kontroluje pre každú analyzovanú vzorku v súlade s 5.3.

5.5.2 Na kontrolu reprodukovateľnosti použite pracovné vzorky. Vzorka sa rozdelí na dve rovnaké časti a analyzuje sa v súlade s metodikou v rôznych laboratóriách alebo v jednom laboratóriu, pričom sa čo najviac menia podmienky analýzy, to znamená, že sa používajú rôzne sady objemového skla, analýzy sa vykonávajú na rôznych dní alebo od dvoch rôznych analytikov.

Reprodukovateľnosť kontrolných analýz sa považuje za uspokojivú, ak \ X-y - X 2 \<

< 0,01 DX, где Л), Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднее арифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 3.

Frekvencia kontroly reprodukovateľnosti - najmenej raz za dva týždne

Tabuľka 3 - Rozsah meraní, hodnota charakteristiky relatívnej chyby a štandardy prevádzkovej kontroly náhodnej zložky relatívnej chyby (konvergencia a reprodukovateľnosť) na úrovni spoľahlivosti P = 0,95

5.5.3 Na kontrolu presnosti použite pracovné vzorky so známym prídavkom benzo(a)pyrénu. Vzorka sa rozdelí na dve rovnaké časti, z ktorých prvá sa analyzuje v súlade s postupom a do druhej sa pridá známa prísada benzo(a)pyrénu a potom sa tiež analyzuje v súlade s postupom. Množstvo aditíva by malo byť 50 – 150 % obsahu benzopyrénu v analyzovanej vzorke.

Presnosť kontrolných analýz sa považuje za uspokojivú, ak | A) - X- c \< К, где Л), X и с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена соответственно; К - норматив оперативного контроля точности.

Napísané v FSUE "STANDARTINFORM" na PC.

Vytlačené na pobočke FSUE STANDARTINFORM - typ. "Moskovská tlačiareň", 105062 Moskva, Lyalin per., 6

GOST R 51650-2000

1 oblasť použitia ................................................. ... ......... jeden

3 Odber vzoriek ................................................... . ............... 2

4 Nízkoteplotná spektrofluorimetrická metóda ................................. 2

4.1 Prístroje, materiály a činidlá .................................................. 2

4.2 Príprava na testovanie ...................................................... ... 3

4.3 Vykonanie testu ................................................ ...... 3

4.4 Spracovanie výsledkov ................................................. ..... 6

4.5 Kontrola presnosti výsledkov analýzy ...................................... 6

5 Metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a spektrofluorimetrie pri

izbová teplota ................................................ ...... 7

5.1 Prístroje, materiály a činidlá ................................................ 8

5.2 Príprava na testovanie ...................................................... ... 9

5.3 Testovanie ................................................ . ...10

5.4 Spracovanie výsledkov ...................................................... .....trinásť

5.5 Kontrola presnosti výsledkov analýzy ...................................... 14

6 Bezpečnostné požiadavky ............................................ 15

7 Požiadavky na kvalifikáciu operátora ................................................ 15

Príloha A Bibliografia

ŠTÁTNY ŠTANDARD RUSKEJ FEDERÁCIE

POTRAVINÁRSKE VÝROBKY Metódy stanovenia hmotnostného zlomku benzo(a)pyrénu

Metódy stanovenia podielu benz(a)pyrénu z celkovej hmotnosti

Dátum predstavenia 2001-07-01

1 oblasť použitia

Táto norma sa vzťahuje na potravinové suroviny, potravinárske výrobky, potravinárske a aromatické prísady a špecifikuje metódy na stanovenie hmotnostného podielu benzo(a)pyrénu pomocou spektrofluorimetrie pri nízkej a izbovej teplote a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.

Všeobecné laboratórne váhy 2. triedy presnosti s maximálnou váhou 500 g podľa GOST 24104.

Rotačný odparovač IR-1M.

Voda do kúpeľa.

Elektrický sporák pre domácnosť s uzavretou špirálou a regulátorom vykurovania v súlade s GOST 14919.

Dewarova nádoba na tekutý dusík ľubovoľnej kapacity

Chromatografické kúpele (smaltované fotokyvety).

Sklenené taniere s rozmermi 15 x 30 a 20 x 40 cm.

Banky К-1-250-29 / 32 ТХС, К-1-100-29 / 32 ТХС, К-1-500-29 / 32 ТХС alebo P-1-500-29 / 32 ТХС v súlade s GOST 33.

Chladničky HIT-1-300-14 / 23 XC alebo HIT-1-400-14 / 23 XC v súlade s GOST 25336.

Chladničky HPT-2-400-29 / 32 XC a HPT-1-300-29 / 32 alebo HPT-400-29 / 32 XC v súlade s GOST 25336.

Spätný kondenzátor 250-19 / 26-29 / 32 ТС alebo spätný chladič 300-19 / 26-29 / 32 ТС v súlade s GOST 25336.

Sklenené skúmavky P2-10-180 XC v súlade s GOST 25336.

Tryska P-1-19 / 26-14 / 23 ТС alebo Н2-19 / 23 v súlade s GOST 25336.

Laboratórne čerpadlo s vodným lúčom v súlade s GOST 25336.

Pipety s kapacitou 1, 2, 5, 10 cm3 v súlade s GOST 29228 a GOST 29229.

Lievik VFO-32-POR 100-14 / 23 XC alebo VFO-32-POR 160-14 / 23 XC v súlade s GOST 25336.

Merané rúrky P-2-15-14 / 23 XC v súlade s GOST 1770.

Oddeľovací lievik VD-1-500 alebo VD-3-500 v súlade s GOST 25336.

Meracie valce 1-100, 1-250 alebo 3-100, 3-250 v súlade s GOST 25336.

Váhy (navažovacie fľaše) SV-14/8 alebo SV-19/9 alebo SV-24/10 alebo SV-34/12 v súlade s GOST 25336.

Teplomer s rozsahom merania teploty 0-250 °C s delením po 1 °C v súlade s GOST 29224.

Sklenené kapiláry, sklenené tyčinky.

n oktán, h., podľa normatívneho dokumentu.

n.hexán, h., podľa normatívneho dokumentu.

Rektifikovaný technický etylalkohol podľa GOST 18300 alebo rektifikovaný etylalkohol podľa GOST R 51652.

Frakcia petroléteru 40 - 70 ° С podľa normatívneho dokumentu.

Oxid hlinitý pre chromatografiu 2. stupňa aktivity podľa normatívneho dokumentu.

Benz (a) pyrén, obsah základnej látky nie je nižší ako 98 %.

1,12-Benzperylén, obsah základnej látky nie je nižší ako 98 %.

Je povolené používať iné meracie prístroje s metrologickými charakteristikami a zariadeniami s technickými charakteristikami, ako aj reagencie a materiály kvality, ktorá nie je nižšia ako uvedená.

4.2 Príprava testu

4.2.1 Čistenie rozpúšťadiel

Rozpúšťadlá (n-oktán, etylalkohol, petroléter, chloroform a n-hexán) sa destilujú bežným spôsobom so spätným chladičom.

4.2.2 Príprava oxidu hlinitého

Oxid hlinitý sa suší v sušiarni pri teplote (250 + 4) ° C počas 4 hodín a uchováva sa v nádobe so zabrúsenou zátkou.

4.2.3 Príprava roztoku benzo(a)pyrénu na tenkovrstvovú chromatografiu (svedecký roztok).

Asi 10 mg benzo(a)pyrénu sa naváži do odvažovačky, pridá sa niekoľko mililitrov petroléteru, kým sa vzorka úplne nerozpustí.

Výsledný roztok sa kvantitatívne prenesie do odmernej banky s objemom 100 cm3 a objem roztoku sa doplní po značku petroléterom. Čas použiteľnosti roztoku nie je dlhší ako tri mesiace v chladničke.

4.2.4 Príprava štandardného roztoku benzo(a)pyrénu

Navážte (10,0 ± 0,2) mg benzo(a)pyrénu do navažovačky, pridajte niekoľko mililitrov n-oktánu, kým sa vzorka úplne nerozpustí. Výsledný roztok sa kvantitatívne prenesie do odmernej banky so zabrúsenou zátkou s objemom 100 cm 3 a doplní sa po značku n-oktánom. Hmotnostná koncentrácia benz(a)pyrénu vo výslednom roztoku je 100 μg/cm3. Roztok uchovávajte v chladničke. Čas použiteľnosti roztoku nie je dlhší ako tri mesiace.

4.2.5 Príprava pracovných roztokov benz(a)pyrénu

Pracovné roztoky benz (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 0,1; 0,04 a 0,02 μg / cm 3 v n-oktáne sa pripraví postupným riedením počiatočného štandardného roztoku benzo (a) pyrénu, pripraveného podľa 4.2.4, v odmerných bankách so zabrúsenou zátkou s objemom 100 cm. 3. Roztoky sa uchovávajú v chladničke. Čas použiteľnosti roztokov nie je dlhší ako jeden mesiac.

4.2.6 Príprava štandardného roztoku 1,12-benzperylénu (vnútorný štandard)

Na prípravu počiatočného roztoku sa do odvažovačky naváži (10,0 + 0,2) mg 1,12-benzperylénu, pridá sa niekoľko mililitrov n-oktánu, kým sa vzorka úplne nerozpustí. Výsledný roztok sa kvantitatívne prenesie do odmernej banky so zabrúsenou zátkou s objemom 100 cm 3 a doplní sa po značku n-oktánom. Hmotnostná koncentrácia 1,12-benzperylénu vo výslednom roztoku je 100 μg / cm3. Roztok uchovávajte v chladničke. Čas použiteľnosti roztoku nie je dlhší ako tri mesiace.

4.2.7 Príprava pracovných roztokov 1,12-benzperylénu (roztoky vnútorných štandardov)

Pracovné roztoky 1,12-benzperylénu s hmotnostnou koncentráciou 0,01; 0,005; 0,002 a 0,001 μg/cm3

pripraviť v n-oktáne postupným riedením zásobného štandardného roztoku pripraveného podľa 4.2.6 v odmerných bankách so zabrúsenou zátkou s objemom 100 cm3. Roztoky sa uchovávajú v chladničke. Čas použiteľnosti roztokov nie je dlhší ako jeden mesiac.

4.3 Vykonanie skúšky

4.3.1 Izolácia benzo(a)pyrénu z produktu

Do banky s guľatým dnom s objemom 500 cm 3 vložte vzorku produktu s hmotnosťou 25 g, do banky pridajte 20 cm 3 destilovanej vody, 200 cm 3 etylalkoholu a 20 g hydroxidu draselného.

Obsah banky sa premieša pretrepaním. Banka sa pripojí k spätnému chladiču a zahrieva sa vo vodnom kúpeli za varu reakčnej zmesi 3 hodiny, potom sa do banky cez chladič pridá 150 cm3 vody; banka sa vyberie z kúpeľa a ochladí sa na teplotu miestnosti.

Po ochladení sa kvapalná fáza reakčnej zmesi prenesie dekantáciou do oddeľovacieho lievika, pričom zvyšok produktu zostane v banke. Do banky so zvyškom sa pridá 150 cm3 n-hexánu, obsah banky sa intenzívne mieša a n-hexán sa dekantuje do oddeľovacieho lievika.

Lievik sa uzatvorí a silno sa pretrepe, potom sa upevní na statív a nechá sa oddeliť kvapaliny. Na oddelenie výslednej emulzie sa k zmesi v deliacom lieviku pridá 20 cm3 etylalkoholu. Po delaminácii sa spodná vodno-alkoholická fáza naleje späť do banky so sedimentom a hexánový extrakt sa naleje do banky s objemom 500 cm3.

Toto spracovanie reakčnej zmesi sa uskutoční ešte dvakrát, pričom sa na extrakciu použije n hexán, 100 cm3 a etylalkohol na exfoliáciu emulzie, v dávkach po 20 cm3.

Na konci extrakcie sa zvyšok v banke a hydrolyzát vyhodia a extrakt sa premyje v oddeľovacom lieviku destilovanou vodou trikrát po 50 cm 3 a po častiach sa odparí v banke s guľatým dnom vopred odváženej do druhé desatinné miesto s objemom 250 cm 3 na rotačnej odparke pri teplote vodného kúpeľa najviac 60 °C. Banka s extraktom sa nechá v digestore, aby sa odstránili stopy rozpúšťadla, a potom sa znova odváži. Rozdiel medzi vážením sa používa na určenie hmotnosti izolovaného extraktu.

Z extraktu v banke odoberte 1/5 dielu do odvažovačky bez váženia. Banka so zvyškom extraktu sa odváži. Do fľaše s časťou extraktu pridajte 0,1 – 0,2 cm 3 „svedeckého“ benz(a)pyrénového roztoku pripraveného podľa 4.2.3. Obsah fľaše a zvyšok banky sa rozpustí v malom objeme petroléteru.

Na chromatografickú separáciu extraktu sa oxid hlinitý rovnomerne naleje na sklenenú platňu s rozmermi 20 x 40 cm. Potom pomocou sklenenej tyčinky, rozdelenej na tri časti (14, 1 a 3 cm) s gumenými krúžkami s hrúbkou 1 mm a šírkou 3 mm, sa oxid hlinitý opatrne vyrovná.

Výsledné roztoky sa kvantitatívne nanesú na pripravenú dosku so sklenenými kapilárami: na úzku časť - roztok z fľaše ("svedok"), na širokú časť - extrakt z produktu z banky. Roztoky sa nanášajú rovnomerne v súvislom páse, vzdialenom od spodného okraja platne 7 - 8 cm.

Platňa sa umiestni do chromatografického kúpeľa pod miernym uhlom 20 ° - 25 °, naleje sa petroléter tak, aby nedosiahol čiaru vzorky. Kúpeľ sa prikryje sklom a uskutoční sa chromatografia, pričom sa čelo rozpúšťadla privedie k hornému okraju platne.

Platničku bez vysušenia ožiarte ultrafialovým svetlom a podľa svetelného pásu „svedka“ určte polohu benzo(a)pyrénu v testovanej vzorke. Označte hranice benz(a)pyrénového pásu na chromatograme testovanej vzorky. Platňa sa suší na vzduchu v digestore.

Prúžok oxidu hlinitého vyznačený na chromatograme testovanej vzorky sa odoberie z platne pomocou podložného skla a kvantitatívne sa prenesie na poréznu platňu filtračného lievika. Lievik sa pripojí k banke s guľatým dnom s objemom 100 cm3 a benzo(a)pyrén sa eluuje z oxidu hlinitého pomocou 50 cm3 benzénu, pridávaním benzénu po malých častiach a miešaním oxidu hlinitého na lieviku tyčinkou. . Benzén sa odparí do sucha na rotačnej odparke pri teplote vodného kúpeľa nie vyššej ako 60 °C. Zvyšok banky sa kvantitatívne prenesie s oktánom do skúmavky. Objem roztoku v skúmavke by nemal presiahnuť 5 cm3.

Pri analýze niektorých produktov nedochádza k úplnému a jasnému oddeleniu fluorescenčných zložiek vzorky počas primárnej chromatografie extraktu izolovaného z produktu. V tomto prípade je na platni na úrovni "svedka" izolovaný širší pás oxidu hlinitého; benz (a) pyrén sa eluuje z oxidu hlinitého benzénom, ako je opísané vyššie, a zvyšok po odparení sa rozpustí v etylalkohole a výsledný alkoholový extrakt sa znovu chromatografuje.

Na chromatografickú separáciu alkoholového extraktu sa používa doska 15 x 30 cm s hrúbkou vrstvy oxidu hlinitého 0,3 mm. Na platni sa oddelia dva prúžky široké 10 a 3 cm Na širokú časť platne sa pomocou sklenenej kapiláry nanesie alkoholový extrakt analyzovaného produktu a roztok benz(a)pyrénu v petroléteri („svedok“). ” roztok) sa nanesie na úzku časť. Platňa sa vloží do kúpeľa pod uhlom 20 - 25° a uskutoční sa chromatografia v chloroforme, pričom sa predná časť rozpúšťadla privedie k hornému okraju platne. V ultrafialovom svetle je označený "svedecký" pásik oxidu hlinitého s benzo(a)pyrénom testovaného produktu. Potom sa benz(a)pyrén eluuje z oxidu hlinitého benzénom a všetky ďalšie operácie sa vykonajú tak, ako je opísané vyššie.

GOST R 51650-2000

Roztok benzo(a)pyrénu v n-oktáne sa prenesie do skúmavky. Objem roztoku by nemal presiahnuť 5 cm 3 s počiatočnou vzorkou produktu 25 g.

Vo výslednom roztoku (extrakte) sa obsah benzo(a)pyrénu stanoví nízkoteplotnou spektrofluorimetriou s použitím adičnej metódy alebo metódy vnútorného štandardu na kvantitatívne vyhodnotenie.

4.3.2 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu v roztoku (extrakte) získanom v 4.3.1 metódou pridávania.

Do troch skúmaviek nalejte pipetou 1 cm 3 výsledného roztoku benzo(a)pyrénu v n-oktáne. Potom sa do prvej skúmavky nalejú 2 cm 3 N. oktánu. Do druhej skúmavky nalejte 1,5 cm 3 N. oktánu a 0,5 cm 3 pracovného roztoku benzo (a) pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 0,1 μg / cm 3, pripraveného podľa 4.2.5. Do tretej skúmavky pridajte 1 cm 3 N oktánu a 1 cm 3 rovnakého pracovného roztoku benzo (a) pyrénu ako v druhej skúmavke.

Spektrofluorometrická analýza začína treťou skúmavkou. Na tento účel sa tretia skúmavka umiestni do Dewarovej banky s tekutým dusíkom pred vstupnú štrbinu spektrofotometra; nastavte analytickú čiaru fluorescencie benzo(a)pyrénu na 403 nm pri vlnovej dĺžke excitačného svetla 367 nm. Úpravou zosilnenia a otvorením štrbiny, ako aj súčasným nastavením skúmavky v Dewarovej banke sa dosiahne maximálny signál záznamovým zariadením spektrofotometra (až 50 - 80 %), po ktorom sa spektrogram benzo a) pyrén sa zaznamenáva v oblasti 401 – 404 nm, pričom hodnota záznamového zariadenia spektrofotometer je stanovená na vlnovú dĺžku 401 nm. Záznam spektra sa opakuje dvakrát.

Potom sa druhá a prvá skúmavka postupne zmrazia v tekutom dusíku a fluorescenčné spektrá sa zaznamenajú v rozsahu vlnových dĺžok 401 - 404 nm, pričom sa uistite, že ste nastavili pero záznamníka na vlnovú dĺžku 401 nm do rovnakej polohy ako pri skenovanie vzorky v tretej skúmavke.

Hmotnostná koncentrácia benzo (a) pyrénu v analyzovanom extrakte sa určí z grafu, na ktorom je na vodorovnej osi vynesená hodnota prídavku benzo (a) pyrénu (μg) a výška maxima charakteristickej čiary. benzo(a)pyrénu pri 403 nm je vynesené pozdĺž osi y, merané zo získaných spektrogramov v milimetroch.

Ak hmotnostná koncentrácia benzo(a)pyrénu v testovacom roztoku spadá do rozsahu vhodného na meranie, potom získané experimentálne body ležia na jednej priamke. Extrapolácia tejto priamky na priesečník s osou x na nej poskytne úsečku zodpovedajúcu obsahu benzo(a)pyrénu v roztoku bez prísady, to znamená v 1 cm 3 skúšobného roztoku. Ak je hmotnostná koncentrácia benz(a)pyrénu v analyzovanom roztoku vyššia ako horná hranica rozsahu koncentrácií nameraných zariadením, potom sa analyzovaný roztok zriedi n-oktánom.

4.3.3 Stanovenie obsahu benzo(a)pyrénu v roztoku (extrakte) získanom podľa 4.3.1 metódou vnútorného štandardu

Ako vnútorný štandard sa použil 1,12-benzperylén. 3 cm 3 roztoku benzo(a)pyrénu v n-oktáne, získaného podľa 4.3.1, sa nalejú do skúmavky a vložia sa do Dewarovej banky s tekutým dusíkom pred vstupnú štrbinu spektrofotometra, analytická čiara sa nastaví na 403 nm pri vlnovej dĺžke excitačného svetla 367 nm a vykoná sa zaznamenávanie spektra roztoku v rozsahu vlnových dĺžok 401 - 409 nm. Podľa intenzity čiary (podľa výšky píku maxima charakteristickej čiary benzo (a) pyrénu pri 403 nm) sa odhaduje približný obsah benzo (a) pyrénu vo vzorke. V súlade s týmto odhadom sa do skúmavky pridá roztok 1,12-benzperylénu s 3 cm 3 roztoku benz(a)pyrénu v n-oktáne v takom množstve, aby intenzita 1,12-benzperylénu v spektre vzorky at

406,3 nm bola 3 až 5-násobkom intenzity línie benz(a)pyrénu pri vlnovej dĺžke 403 nm.

Spektrum sa zaznamenáva v intervale vlnových dĺžok 401 - 409 nm dvakrát.

Intenzity charakteristických čiar benzo (a) pyrénu pri 403 nm a 1,12-benzperylénu pri

406,3 nm (H | a H 2, v tomto poradí) sa určí zo spektrogramov merajúcich výšky píkov v maximách charakteristických čiar týchto zlúčenín v milimetroch. Pri výpočtoch sa berie priemerná hodnota. Vypočítajte pomerový koeficient (K) intenzity čiary benz(a)pyrénu (EHD k intenzite čiary 1,12-benzperylénu (EG 2), K = //] /// 2.

Ďalej je tento koeficient určený pre štandardné roztoky benzo(a)pyrénu (X st). Na tento účel sa do dvoch skúmaviek nalejú 3 cm3 štandardných roztokov benzo(a)pyrénu s hmotnostnou koncentráciou 0,02 a 0,04 μg / cm3. Do každej zo skúmaviek sa naleje rovnaké množstvo 1,12-benzperylénu ako do skúmavky so vzorkou. Spektrá každého roztoku sa zaznamenávajú dvakrát v rozsahu vlnových dĺžok 401 - 409 nm.

V tomto prípade je nevyhnutné, aby poloha pera rekordéra pri vlnovej dĺžke 401 nm bola vo všetkých prípadoch pevne stanovená na rovnakej úrovni.

Ďalej spektrogramy určujú intenzitu charakteristických čiar benzo(a)pyrénu pri 403 nm a 1,12-benzperylénu pri 406,3 nm (H a H2, v tomto poradí). Pri výpočtoch sa berie priemerná hodnota. Vypočítajte K st = H ^ H 2 pre každú koncentráciu benzo (a) pyrénu.

Hmotnostná koncentrácia benz(a)pyrénu v analyzovanom roztoku c, μg / cm 3 sa vypočíta podľa vzorca:

s s st * K / K st, (1)

kde c st je koncentrácia benzo (a) pyrénu v štandardnom roztoku, μg / cm 3;

K je koeficient zistený zo spektrogramu analyzovaného roztoku s prídavkom 1,12-benzperylénu;

K C1 je koeficient zistený zo spektrogramov štandardného roztoku benzo(a)pyrénu s prídavkom 1,12-benzperylénu, ktorého hodnota sa hodnotou približuje koeficientu analyzovaného roztoku so zodpovedajúcim prídavkom 1. ,12-benzperylén.

Vykonajú sa dve paralelné stanovenia a súčasne sa uskutoční kontrolný experiment vo všetkých fázach analýzy s použitím všetkých činidiel podľa metodiky, ale bez vzorky produktu.

4.4 Vyjadrenie výsledkov

Hmotnostný podiel benzo (a) pyrénu L), %, X a X 2, mg / kg, sa vypočíta podľa vzorcov:

= (s - ep) ■ m l V ■ 100 = (s - ep) ■ t 1 ■ V (2)

3 t 2 ■ t ■ 1 000 ■ 1 000 t 2 ■ t '

_ (s - s 0) ■ V ■ t 1 (3)

kde c je koncentrácia benzo(a)pyrénu stanovená podľa 4.3.2 alebo 4.3.3 v roztoku (extrakte) analyzovaného produktu získaného podľa 4.3.1, μg/cm 3; с 0 - koncentrácia benzo (a) pyrénu v roztoku z kontrolného experimentu získaného v 4.3.1, μg / cm 3; V je objem roztoku benzo(a)pyrénu izolovaného z analyzovanej vzorky produktu, cm3;

/ „I je hmotnosť extraktu izolovaného z analyzovaného produktu, g; t 2 je hmotnosť extraktu naneseného na široký pás platne, g; t je hmotnosť vzorky produktu, g.

Výsledok sa zaokrúhli na druhú platnú číslicu.

Za konečný výsledok stanovenia sa berie aritmetický priemer dvoch paralelných stanovení s rovnakým počtom platných číslic.

Ak rozdiel medzi výsledkami paralelných stanovení nepresiahne | A) - X 2 \<

< 0,01яЖ, где Xi, Х 2 и X- результаты первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое, a d- норматив контроля сходимости, то среднеарифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива контроля сходимости d приведено в таблице 1.

Na základe získaného výsledku analýzy X a hodnoty relatívnej chyby q uvedenej v tabuľke 1 vypočítajte absolútnu chybu A = 0, (SD mg / kg alebo %.

Výsledok analýzy je prezentovaný ako (X ± A), mg/kg alebo % pri P = 0,95.

4.5 Kontrola presnosti výsledkov analýzy

Vnútorná prevádzková kontrola (EQA) kvality výsledkov analýzy zahŕňa kontrolu konvergencie, reprodukovateľnosti a presnosti výsledkov analýzy.

4.5.1 Opakovateľnosť paralelných stanovení sa kontroluje pre každú analyzovanú vzorku v súlade s 4.4.

4.5.2 Na vnútornú kontrolu reprodukovateľnosti použite pracovné vzorky. Vzorka sa rozdelí na dve rovnaké časti a analyzuje sa v súlade s metodikou v rôznych laboratóriách alebo v jednom laboratóriu, pričom sa čo najviac menia podmienky analýzy, to znamená, že sa používajú rôzne sady objemového skla, analýzy sa vykonávajú na rôznych dní alebo od dvoch rôznych analytikov.

Reprodukovateľnosť kontrolných analýz sa považuje za uspokojivú, ak \ X ^ - X 2 \<

< 0,01 DX, где X/, Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднеарифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 1.

GOST R 51650-2000

Frekvencia kontroly reprodukovateľnosti je najmenej raz za dva týždne.

Tabuľka 1- Rozsah merania, hodnota charakteristiky relatívnej chyby a štandardy prevádzkovej kontroly náhodnej zložky relatívnej chyby (konvergencia a reprodukovateľnosť) na úrovni spoľahlivosti P = 0,95

4.5.3 Na kontrolu presnosti použite pracovné vzorky so známym prídavkom benzo(a)pyrénu. Vzorka sa rozdelí na dve rovnaké časti, z ktorých jedna sa analyzuje v súlade s postupom; v druhom sa zavedie známa prísada benzo(a)pyrénu a potom sa tiež analyzuje v súlade s postupom. Množstvo aditíva by malo byť 50 – 150 % obsahu benzopyrénu v analyzovanej vzorke.

Presnosť kontrolných analýz sa považuje za uspokojivú, ak \ Xy-X- c \< 0,01 К, где Ху, Xи с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена, соответственно; К- норматив оперативного контроля точности. Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формулам: при проведении внутрилабораторного контроля (Р = 0,90)

K = 0,84 V (Ax])2 + (Ax)2; (4)

počas externej kontroly (P = 0,95)

K = V (A ^) 2 + (Az) 2, (5)

kde A ^ + A x sú hodnoty chybovej charakteristiky zodpovedajúcej hmotnostnej koncentrácii

benzo a) pyrén v doplnkovej vzorke av reálnej vzorke;

Ay, = 0,01 Xy a A x = 0,01 d x X, kde Xy a X sú hmotnostný zlomok benzo(a)pyrénu vo vzorke s prídavkom

a v reálnej vzorke % alebo mg/kg.

Hodnota relatívnej chyby dx (8y) je uvedená v tabuľke 1.

Presnosť analýzy sa kontroluje aspoň raz za mesiac, ako aj pri výmene činidiel alebo po dlhšej prestávke v práci.

Ak sú prekročené normy pre prevádzkovú kontrolu presnosti, vykonajú sa opakované analýzy. Pri opätovnom prekročení stanovených noriem sa analýzy prerušia, zistia sa príčiny, ktoré viedli k nevyhovujúcim výsledkom, a odstránia sa.

Výsledky EQA sa zaznamenávajú do špeciálneho denníka.

5 Metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a spektrofluorimetrie pri izbovej teplote

Podstata metódy spočíva v extrakcii uhľovodíkov vrátane benz(a)pyrénu hexánom z produktu vopred upraveného alkoholovým roztokom hydroxidu draselného, ​​izolácii frakcie polycyklických aromatických uhľovodíkov s obsahom benzo(a)pyrénu a purifikácia výslednej frakcie od rušivých nečistôt na kolóne Sephadex a v tenkej vrstve acetylovanej celulózy, po ktorej nasleduje kvantitatívne stanovenie izolovaného benz(a)pyrénu vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou alebo spektrofluorimetriou pri teplote miestnosti.

Rozsah stanovených hodnôt hmotnostného zlomku benz(a)pyrénu v analyzovaných produktoch metódou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a metódou spektrofluorimetrie pri izbovej teplote 0,0001-0,002 mg/kg alebo 0,1 x 10 - 7 - 2,0 x 10 -7 % ... Optimálny rozsah stanovených hmotnostných koncentrácií benzo(a)pyrénu v roztoku pri použití metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie je 0,01-0,02 μg / cm3, pri použití metódy spektrofluorimetrie - 0,02-0,2 μg / cm3.

Benzapyrén patrí do triedy polycyklických aromatických uhľovodíkov – PAH. Ide o skupinu organických zlúčenín, ktorých chemická štruktúra obsahuje benzénové kruhy - skupiny troch alebo viacerých kruhov. Chemická definícia benzopyrénu: organická látka obsahujúca uhlík patriaca do skupiny polycyklických uhľovodíkov s molárnou hmotnosťou 252,31 g/mol.

Čo je benzopyrén

Benzapirén, ako všetky PAU, je hlavne výsledkom technického pokroku, dôsledkom ľudskej činnosti. Hlavnými zdrojmi antropogénneho znečistenia PAU sú spaľovanie pevných a kvapalných organických látok vrátane ropy a ropných produktov, dreva a antropogénneho odpadu. Z prírodných zdrojov benzopyrénu stojí za zmienku lesné požiare, sopečné erupcie.

K tvorbe benzopyrénu však môže dochádzať aj bez spaľovacích procesov – pri pyrolýze, tlení, polymerizácii.

Benzapirén sa uvoľňuje pri fajčení: obsah benzopyrénu v dyme jednej cigarety je v priemere 0,025 μg, čo je mnohonásobne viac ako MPC (v priemere 10 000 - 15 000-krát). Bolo vypočítané, že vyfajčenie jednej cigarety z hľadiska obsahu benzopyrénu zodpovedá šestnástim hodinám vdychovania výfukových plynov.

Benzapyrénový vzorec

Existujú dva izoméry benzopyrénu. Prvým je 1,2-Benzapirén (3,4-benzpyrén), ktorý je obsiahnutý vo všetkých produktoch spaľovania - olej, decht, uhlie, dym rôzneho pôvodu, vrátane. Vo svojej čistej forme sú to ihlovité kryštály alebo platne svetložltej farby s teplotou topenia asi 177 ° C.

4,5-Benzopyrén - kryštály vo forme ihiel a svetložltých plátov s teplotou topenia 179 ° C. Obsiahnuté v uhoľnom dechte, ktorý sa nachádza v pôde (najmä v blízkosti podnikov a diaľnic). Nemá mutagénne, karcinogénne vlastnosti.

Chemický vzorec benzopyrénov je C20H12.

Benzapyrén v pôde a vzduchu

Benzapyrén sa prakticky nevyskytuje vo voľnom stave, ale vždy sa ukladá na časticiach obsiahnutých vo vzduchu. Spolu s pohybujúcimi sa vzduchovými hmotami sa benzopyrén rozprestiera na veľkej ploche a vypadávajúci spolu s pevnými časticami zo vzduchu (napríklad pri zrážkach) dopadá do pôdnych vrstiev, vodných plôch, na povrch budov.

Jeho zdroj, cestná doprava, tiež zohráva úlohu pri migrácii a akumulácii benzopyrénu. Na jednej strane pri cestovaní na veľké vzdialenosti autá prispievajú k rovnomernej distribúcii benzopyrénu. Na druhej strane sa usadený benzopyrén vo veľkom hromadí pri diaľniciach a v zariadeniach v ich blízkosti (tzv. „sekundárne zdroje“).

Benzapyrén je ľahko „zahrnutý“ do kolobehu látok v prírode: pri atmosférických zrážkach, ktoré vždy obsahujú pevné častice, sa dostáva aj do oblastí vzdialených od hlavného zdroja PAU, vstupuje do vodných útvarov, odkiaľ pri vyparovaní stúpa nahor. opäť do vzduchu. Práve táto schopnosť benzopyrénu migrovať vedie k tomu, že jeho obsah môže byť vysoký na miestach, kde nie je silný zdroj tejto látky.

Benzopyrén, ktorý sa dostáva do prostredia a hromadí sa v ňom, preniká do rastlín, ktoré neskôr slúžia ako krmivo pre hospodárske zvieratá alebo sa využívajú vo výžive ľudí. Koncentrácia benzopyrénu v rastlinách je vyššia ako jeho obsah v pôde a v potravinách (alebo krmivách) je vyššia ako v surovinách na ich výrobu. Tento efekt zvýšenia koncentrácie chemikálií, vrátane benzopyrénu, sa nazýva bioakumulácia.

Benzopyrén je teda nebezpečný nielen ako pozadie znečistenia životného prostredia, ale aj ako látka, ktorá sa do tela dostáva cez potravinový reťazec.

MPC benzopyrén

Hlavnou metódou na stanovenie a kontrolu benzopyrénu je kvapalinová chromatografia.

Podľa Hygienických noriem 2.1.6.695-98 a 2.1.6.1338-03 je maximálne prípustné priemerné denné množstvo benzopyrénu v ovzduší (MPCss) 0,1 μg / 100 m3 alebo 10-9 g / m3 a jeho MPC v pôda je podľa Hygienických noriem 2.1 7.2041-06 - celkovo 0,02 mg/kg, berúc do úvahy úroveň pozadia. Vo vzduchu na pracoviskách nie je priemerná maximálna prípustná koncentrácia posunu väčšia ako 0,00015 mg/m3. (z položky 1 a položky 2. GN 2.2.5. 1313-03).

MPC benzopyrénu vo vode nie je viac ako 0,000001 mg / l, v pitnej vode s centralizovaným vodovodným systémom - nie viac ako 0,000005 mg / l. V balenej pitnej vode - od nie viac ako 0,001 μg / l (voda vysokej kvality) do nie viac ako 0,005 μg / l v balenej vode prvej kategórie kvality.

V potravinárskych výrobkoch, v ktorých je prítomnosť benzopyrénu prípustná kvôli technologickým vlastnostiam, nie je prípustná hladina benzopyrénu vyššia ako 0,001 mg / kg. Patria sem: klobásy a výrobky s použitím vedľajších produktov vrátane údených; údená slanina; klobásy a údené výrobky z mäsa a hydinových drobov; údené konzervy a rybie konzervy, údené ryby; potravinárske obilie.

Pri použití dymových dochucovadiel nie je obsah benzopyrénu vyšší ako 2 μg / kg (l) a po ich použití by obsah benzopyrénu v hotových výrobkoch nemal prekročiť 0,03 μg / kg (l).

Benzopyrén nie je povolený v iných potravinách.

Normy obsahu benzopyrénu sú však podľa výsledkov monitorovania mnohonásobne prekročené. V priemere je úroveň znečistenia ovzdušia v mestách 5-12 krát vyššia ako MPC, v pôde - 3-7 krát, v potravinách - od 1,5 do 11 krát.

Účinok benzopyrénu na ľudský organizmus

Benzapiren je klasifikovaný ako látka 1. triedy nebezpečnosti. Prvou triedou nebezpečnosti sú látky s mimoriadne vysokým nebezpečným vplyvom na životné prostredie, pričom zmeny nimi spôsobené sú nezvratné a nedajú sa obnoviť.

Benzapirén je jedným z najsilnejších a najrozšírenejších karcinogénov. Keďže je chemicky a tepelne stabilný, má bioakumulačné vlastnosti, dostáva sa do tela a hromadí sa v ňom a pôsobí neustále a silne. Okrem karcinogénneho účinku má benzopyrén mutagénne, embryotoxické, hematotoxické účinky.

Cesty vstupu benzopyrénu do tela sú rôzne: s jedlom a vodou, cez kožu a inhaláciou. Stupeň nebezpečenstva je bez ohľadu na to, ako sa benzopyrén dostane do tela. Pri pokusoch, ako aj podľa údajov z monitorovania z ekologicky nepriaznivých oblastí sa do komplexu DNA dostáva benzopyrén spôsobujúci nezvratné mutácie, ktoré sa prenášajú na ďalšie generácie. Obzvlášť znepokojujúca je skutočnosť bioakumulácie benzopyrénu: pravdepodobnosť mutácií v ďalších generáciách potomstva sa v dôsledku bioakumulácie mnohonásobne zvyšuje.

CHCETE PRESTAŤ FAJČIŤ?

Potom sa k nám môžete pridať na maratón odvykania od cigariet.
Bude to oveľa jednoduchšie prestať.

4.1.2. Technika merania hmotnostného podielu benzo(a)pyrénu v potravinových surovinách, potravinových produktoch a pôde pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie

Účel a rozsah

Technika je určená na kvantitatívne stanovenie benzo(a)pyrénu (BP) v potravinových surovinách, potravinárskych výrobkoch a pôde v hmotnostnom podiele uvedenom v tabuľke. 1. Dolná hranica meracieho rozsahu zodpovedá 1/2 prípustnej hladiny (obsahu) toxínu vo výrobkoch a surovinách, horná hranica päťnásobku prípustnej hladiny.

Benz (a) pyrén je vysoko toxická karcinogénna zlúčenina a jeho prípustný obsah v potravinárskych výrobkoch a potravinových surovinách je stanovený hygienickými predpismi a normami SanPiN 2.3.2.560-96.

Techniku ​​môžu aplikovať inštitúcie Štátneho sanitárneho a epidemiologického dozoru Ruskej federácie, laboratóriá iných organizácií a podnikov súvisiacich s výskumom, chemickou analýzou a certifikáciou potravinárskych výrobkov. Metodika nie je arbitráž.

Ryža. 11.14.

• 1. Naftalén 9. Chryzén ​​(0,17 *)
• 2. Acenaftén (1,40*) 10. Benz (a) pyrén
• 3. Fluór (2,60 *) 11. Benz (b) fluorantén (0,26 *)
• 4. Fenantrén * 2,40 *) 12. Benz (c) fluorantén (0,10 *)
• 5. Antracén (0,13*) 13. Benz(a)pyrén (0,2*)
• 6. Fluorantén (0,74 *) 14. Dibenz (a, b) antracén
• 7. Pyrén (0,67 *) 15. BeH3 (g, h, i) nepHaen (0,21 *)
• 8. Benz (a) antracén (0,07 *) 16. Indeno (1,2,3-cc1) pyrén (0,26 *)

Podmienky analýzy:

Kolóna: Supelcosil® LC RAS ​​​​(250 mm x 2,1 mm; 5 μm);

Gradient: acetonitril (A) 50-100 %, voda (B) 50-0 %; 200 μl / min Teplota: 25 ° С Objem vzorky: 10 μl Detekcia: СChrípka, podľa programu

Charakteristiky neistoty merania

Hranice relatívnej chyby (± 5) výsledku merania hmotnostného zlomku TK (s úrovňou spoľahlivosti 0,95) sú uvedené v tabuľke. jeden.

Stôl 1. Analyzované objekty, rozsahy a charakteristiky meraní

Skupina produktov (analyzovaný objekt)	Platný obsah ( IV X), mg/kg	Rozsah merania hmotnostnej frakcie BP, mg / kg	Koeficient extrakcia,	Hranice relatívnej chyby (± 8), %
Údené mäso, ryby a tukové výrobky

Meracie prístroje, pomocné zariadenia, materiály a činidlá

Meracie prístroje

Kvapalinové chromatografy:

• - Mikrokolóna "Milichrom-5", TU 25-7405.0009-89, verzia 3 s fluorometrickým (FLD) detektorom (možnosť 1).
• - Izokratický alebo gradientový kvapalinový chromatograf, napríklad "Kpayer" (Nemecko), Štátny register meracích prístrojov Ruskej federácie 16848-97 alebo Chromatografický nástavec "HPZhKh-3", LLP "Lumex" (St. Petersburg), vybavený FLD "Fluorat-02" -2M ", LLP" Lumex ", Štátny register meracích prístrojov Ruskej federácie 14093-99 (možnosť 2).
• - Izokratický alebo gradientový kvapalinový chromatograf s FLD akéhokoľvek typu, napríklad "Kpayer" (Nemecko), Štátny register meracích prístrojov Ruskej federácie 16848-97 (možnosť 3).

Chromatografické kolóny "Diasfer-110-S 16", TU 4215-001-05451931-94, CJSC "BioKhimMak ST" (Moskva), so štandardnými veľkosťami zodpovedajúcimi variantu chromatografického systému:

• - 2 x 80 mm, dp = 5 - 7 mikrónov (Možnosť 1)
• - 2 x 150 mm, dp = 5 - 7 mikrónov (Možnosť 2)
• - 4 x 150 mm, dp = 5 - 7 mikrónov (možnosť 3)

Hardvérový a softvérový komplex "MultiChrom-Spectrum", TU AZHRT

3.036.001, JSC "Ampersand" (Moskva), alebo akýkoľvek iný softvér, ktorý umožňuje kalibráciu a kvantitatívne stanovenie metódou externého štandardu.

GSO 7515-98 zloženie roztoku benz (a) pyrénu v acetonitrile s hmotnostnou koncentráciou benz (a) pyrénu 100 μg / cm 3, AOZT "Ekros" (St. Petersburg).

GSO 7064-93 zloženie roztoku benz (a) pyrénu v hexáne s hmotnostnou koncentráciou benz (a) pyrénu 100 μg / cm 3, AOZT "Ekros" (St. Petersburg).

Elektronické laboratórne váhy 4 cl. presný model VLE 134, GOST 24104-88 alebo iné.

Mikrostriekačky, 100 μl Hamilton, model Microliter # 1710 alebo ekvivalent.

Mikropipety 0,5; 0,2; 0,1 μl; GOST 20292-74.

Meracie valce 2-25,2-50, 2-100 a 2-500, GOST 1770-74.

Odmerné banky 2-10-2, 2-100-2, GOST 1770-74.

Odstupňované pipety 1, 2, 5, 10 cm 3, GOST 29227-91.

Činidlá a materiály

Acetonitril pre kvapalinovú chromatografiu, stupeň vysokej čistoty OP-3, TU 6-09-14-2167-84, rektifikovaný.

Dvakrát destilovaná voda, TU 6-09-2502-77.

Hexán, chemicky čistý, TU 6-09-3375-78, sušený nad Na 2 S 04 opravené.

Benzén, chemicky čistý, GOST 5955-75, sušený nad Na 2 S 04 opravené.

Bezvodý síran sodný, chemicky čistý, GOST 4166-76.

Koncentračné kazety "Diapak": A-3, P-3, S; TU 4215-002-05451931-94, CJSC BioChimMak ST (Moskva).

Pomocné zariadenia

Systém na filtráciu a odplynenie eluentov ZAO BioKhimMak ST (Moskva) alebo iné.

Sklenené liekovky na kalibračné a analytické roztoky s objemom 1,8 a 5,0 cm 3 so skrutkovacím uzáverom a teflónovým tesnením od Supelco, katalógové čísla 2-6951, 2-7037 a

2-7039 alebo podobne.

Mikro mixér PPE-3, Ekros (Petrohrad).

Rotačný odparovač IR-1M2, TU 25-1173.102-84 alebo iné.

Banky s špicatým dnom so zátkami s objemom 25, 10 a 5 cm3, GOST 25336.

Zariadenie na odfukovanie roztokov v prúde dusíka, vybavené termostatovaným hliníkovým blokom (kúpeľ suchého vzduchu) JV "BioMark" (Ľvov) alebo iné.

Membránové filtre s dp = 0,4-0,5 mikrónov.

Zariadenie na vytvorenie vákua asi 7 mm Hg. čl. (vodné čerpadlo, GOST 25336; vodnokruhové vákuové čerpadlo "Begemot", UVK-RK2 / 1, JSC "BioKhimMak ST", Moskva).

Vákuové zariadenie na prípravu vzoriek (vákuové potrubie) alebo iné s prijímačmi vzoriek s objemom najmenej 10 cm3.

Buchnerova banka, Bunsenov lievik s objemom najmenej 500 a 200 cm3, GOST 1770.

Oddeľovací lievik s objemom 100 a 500 cm 3, GOST 25336.

Kužeľové banky s plochým dnom so zátkami s objemom 50, 100 a 250 cm3, GOST 25336.

Banky v tvare hrušky so zátkami s objemom 50 a 100 cm 3, GOST 25336.

Kužeľový lievik s priemerom najmenej 10 cm, GOST 1770.

Filtračný papier typu "modrá stuha".

Nesterilná lekárska vata, bavlna.

Metóda merania

Technika zahŕňa tieto základné postupy:

• - primárna extrakcia hexánom a opätovná extrakcia do acetonitrilu BP zo vzorky údeného produktu;
• - primárna extrakcia BP zmesou acetonitril-voda zo vzorky obilia alebo pôdy;
• - koncentrácia a čistenie primárneho extraktu extrakciou v tuhej fáze;
• - zriedenie pripraveného extraktu vzorky zmesou acetonitril-voda;
• - kalibrácia chromatografu roztokmi so známou hodnotou hmotnostnej koncentrácie BP;
• - analýza roztoku pripraveného extraktu vzorky vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s registráciou fluorescenčného signálu;
• - identifikácia stanoveného TK pomocou retenčných parametrov;
• - výpočet hmotnostnej koncentrácie BP na základe zaznamenaného analytického signálu a kalibračných charakteristík;
• - výpočet hmotnostného podielu BP na základe hmotnostnej koncentrácie BP, hmotnosti vzorky potraviny a objemu pripraveného roztoku extraktu.

Bezpečnostné požiadavky

Pri práci s použitými chemickými zlúčeninami je potrebné dodržiavať bezpečnostné požiadavky stanovené pre prácu s toxickými, žieravými a horľavými látkami, GOST 12.1.018-86 a GOST 12.1.004-76, požiadavky požiarnej bezpečnosti, GOST 12.1.004 -76.

Ak sa roztoky BP dostanú na pokožku alebo povrch predmetov, je potrebné ich ošetriť vodou so saponátom a potom etylalkoholom. Roztoky skladujte v chladničke v uzavretom obale.

Pri prevádzke systému pre HPLC a vykonávaní zodpovedajúcich meraní je potrebné dodržiavať pravidlá elektrickej bezpečnosti, GOST

12.1.019-79 a návod na použitie zariadenia.

Požiadavky na kvalifikáciu operátora

Osoby môžu pracovať:

• - kvalifikovaný ako chemický inžinier alebo chemický technik;
• - s praxou v chemickom laboratóriu;
• - absolvoval príslušné školenia a stáže v laboratóriách akreditovaných na vykonávanie analýz pomocou HPLC;
• - tí, ktorí získali pozitívne výsledky pri vykonávaní kontrolných operácií.

Podmienky merania

Príprava vzoriek, príprava roztokov, príprava a merania sa vykonávajú pri teplote okolia 18-25 °C, atmosférickom tlaku 84,0-100,7 kPa (630-800 mm Hg), vlhkosti vzduchu maximálne 80 % (pri teplote 25 °C C).

Pri meraní v laboratóriu musia byť splnené nasledujúce podmienky: napätie v sieti 220 ± 10 V, frekvencia prúdu v sieti 50zh 1 Hz. Merania sa vykonávajú za podmienok odporúčaných popisom a návodom na použitie prístroja.

Príprava na meranie

Sklo

Pred ďalším použitím sa použité sklo opláchne posledným z použitých rozpúšťadiel a dôkladne sa umyje horúcou vodou s akýmkoľvek detergentným práškom, postupne sa opláchne destilovanou a dvakrát destilovanou vodou a vysuší. Čistý riad skladujte korkovým alebo vatovým tampónom.

Odber vzoriek, skladovanie a manipulácia

Odber vzoriek a priemerovanie vzoriek sa vykonáva v súlade s regulačnými dokumentmi pre každý typ výrobku (GOST 13586.3-83, GOST 27668-88, GOST 9792-73, GOST 7631-85). Stanovený BP sa zo vzoriek údených produktov extrahuje extrakciou suchým hexánom, po odparení ktorého sa reextrahuje do acetonitrilu. Pri extrakcii BP zo vzoriek obilia alebo pôdy sa používa zmes voda-acetonitril (16:84). Následné zahusťovanie a čistenie primárneho extraktu vzorky obsahujúcej BP, bez ohľadu na povahu východiskového produktu, sa vykonáva v súlade s komplexnou schémou extrakcie tuhou fázou pomocou troch diapakových koncentračných patrón A-3, P-3, C .

Pripravené vzorky (extrakty vzoriek) sa rozpustia v zmesi acetonitril-voda (70:30).

Každé meranie hmotnostnej frakcie BP zahŕňa prípravu a chromatografickú analýzu aspoň dvoch vzoriek.

Príprava zmesí rozpúšťadiel

Zmesi rozpúšťadiel sa pripravujú volumetrickou metódou v odmerných valcoch. Požadované objemy acetonitrilu a vody sa odmerajú samostatnými odmernými valcami a potom sa zmiešajú. Extrakt A: zmes acetonitril-voda (84:16).

Príprava extraktantov

Na prípravu vzájomne nasýteného acetonitrilu a hexánu sa asi 300 cm3 acetonitrilu a 100 cm3 hexánu pretrepáva v oddeľovacom lieviku s objemom 500 cm3. Po oddelení rozpúšťadiel sa vrstvy oddelia oddelene: spodná (acetonitril nasýtený hexánom - extrakčné činidlo B) a vrchná (hexán nasýtený acetonitrilom - extrakčné činidlo C), medzifáza sa zahodí.

Príprava eluentov

Pre HPLC merania sa pripravia zmesi acetonitril-voda v nasledujúcich pomeroch: (90:10) - eluent 90, (84:16) - eluent 84, (80:20) - eluent 80, (70:30) - eluent 70 Hotové eluenty sa prefiltrujú cez membránový filter a uskutoční sa vákuové alebo tepelné odplynenie.

Príprava kalibračných roztokov

Vzorka štátneho štandardu zloženia roztoku BP v acetonitrile (pozri vyššie) sa pred použitím zriedi zmesou acetonitril-voda (7:3). Vezmite pipetou

1,0 cm 3 zásobného roztoku, vložte do odmernej banky s objemom 100 cm 3 a pridajte rozpúšťadlo po značku. Potom pomocou pipety odoberte určité objemy výsledného roztoku, vložte ich do odmernej banky s objemom 10 cm 3 a pridajte rozpúšťadlo po značku. Zodpovedajúce objemy roztokov použitých na riedenie a koncentrácie kalibračných roztokov 2-5 (možnosť 1) a 3-7 (možnosť 2, 3) sú uvedené v tabuľke. 2. Pri použití GSO zloženia roztoku BP v hexáne (pozri nižšie), po odparení rozpúšťadla za podmienok uvedených nižšie, sa suchý zvyšok znovu rozpustí v acetonitrile a zriedi sa, ako je opísané vyššie, berúc do úvahy hodnotu certifikovaného koncentrácia GSO.

Tabuľka 2 Kalibračné roztoky na analýzu benzopyrénu (BP).

Hmotnostná koncentrácia BP (certifikovaná hodnota GSO), μg / cm3	Zásobný roztok na riedenie		Kalibrácia
				Hmotnostná koncentrácia BP, μg / cm3

* Nepoužíva sa na priamu kalibráciu chromatografického systému.

Príprava chromatografického systému

Chromatograf je zapnutý a pripravený na prevádzku v súlade s jeho popisom a návodom na obsluhu. Kolónu „Diasfer-110-C 16“ nastavte na štandardné veľkosti v súlade s možnosťou chromatografu (pozri vyššie). Eluent s najvyššou koncentráciou acetonitrilu sa čerpá cez chromatografický systém, kým sa nestabilizuje základná línia detektora, a potom sa kondicionuje za počiatočných podmienok gradientu podľa zodpovedajúcich častí „Podmienky analýzy“.

Príprava koncentračných kaziet

Koncentračné kazety Diapak A-3 a P-3 sú pripravené na prevádzku nasledovne:

• 1. Do polypropylénového puzdra s objemom 10 cm 3 s vymeniteľným filtrom v spodnej časti sa nalejú 3 cm 3 suchého sorbentu diapak A alebo P. Horná prázdna časť puzdra slúži ako lievik na nanášanie a. vzorka alebo eluent.
• 2. Namontujte kazetu vertikálne do vhodného evakuačného zariadenia a vklepte do rovnomernej vodorovnej vrchnej vrstvy sorbentu. Na konečnú prípravu kazety Diapak A-3 stačí zafixovať vrstvu sorbentu malým vatovým tampónom.
• 3. Na prípravu patróny Diapak P-3 sa sorbent premyje postupne 10 cm 3 benzénu, acetónu a extraktant A so slabou evakuáciou (rýchlosť odkvapkávania nie viac ako 1-2 kvapky za sekundu), ktorá zabraňuje vniknutiu vzduchu do sorbentu. Po naplnení patróny acetónom sa sorbent nechá usadiť, zavedie sa horný polymérový filter, zhutní sa cez hornú vrstvu sorbentu a pokračuje sa v preplachovaní. Po dosiahnutí extraktant A na úrovni 2-3 cm nad filtrom sa preplachovanie zastaví a náplň sa utesní spodnou zátkou a horným uzáverom (na uskladnenie). V prípade náhodného vysušenia sa kazeta umyje extraktant A. Pred nanesením vzorky sa zátky odstránia a za slabej evakuácie sa zvyšky zmesi voda-acetonitril prenesú na úroveň horného filtra, potom sa ihneď naleje skúšobný roztok. Regenerácia opakovane použiteľnej kazety Diapak P-3 sa vykonáva podľa podobnej schémy, s výnimkou odstránenia horného filtra.

Koncentračná kartuša diapak C je pripravená na prácu nasledovne:

• 1. Hotová polypropylénová kapsula s 1 cm 3 sorbentu Diapak C je uzavretá zátkami. Po odstránení zátok sa náplň pripraví na prácu tak, že sa cez ňu injekčnou striekačkou nechá prejsť 5 cm3 hexánu rýchlosťou kvapkania 1-2 kvapky za sekundu.
• 2. Vzorka sa aplikuje gravitačne pomocou prázdneho polypropylénového puzdra s objemom 10 cm 3 ako lievika, tesne upevneného v hornej armatúre kapsuly Diapak C.

Príprava vzorky na meranie

Extrakcia benz(a)pyrénu hexánom zo vzorky údeného produktu Odvážená dávka 10,0 g vzorky údeného produktu sa rozomelie v mažiari s 30 g bezvodého síranu sodného. Zmes sa kvantitatívne prenesie do banky s plochým dnom s objemom 100 cm3 a extrahuje sa hexánom v objeme 40 cm3 počas najmenej 30 minút za miešania. Primárny hexánový extrakt z celkového tuku vzorky sa dekantuje a vedie cez 10 g bezvodého síranu sodného do stripovacej banky. Extrakčný postup sa dvakrát opakuje s dvoma objemami 20 cm3 hexánu a časti extraktu sa nechajú prejsť cez sušidlo do tej istej stripovacej banky. Hexán sa odparuje na rotačnej odparke pri teplote nie vyššej ako 35 °C, kým nezmizne zápach.

Celkový tukový extrakt sa rozpustí v 20 cm3 extraktant B, kvantitatívne preneste do odmerného valca s objemom 50 cm 3 a objem roztoku upravte na 40,0 cm 3 rovnakým rozpúšťadlom.

20,0 cm3 výsledného roztoku sa prenesie do oddeľovacieho lievika s kapacitou 100 cm3 a reextrakcia BP do acetonitrilu sa uskutoční v troch objemoch po 20 cm3. extraktant B. Zakaždým, keď sa dosiahne čo najúplnejšie oddelenie fáz, spodná vrstva (acetonitrilový extrakt BP) sa odoberie a odparí na rotačnej odparke pri teplote nepresahujúcej 50 °C. °C do objemu 10-15 cm3. Kvantitatívne (pomocou acetonitrilu) prelejte roztok do odmerného valca s objemom 25 cm 3 , objem doplňte acetonitrilom na 21,0 cm 3 , pridajte 4,0 cm 3 dvakrát destilovanej vody a výslednú zmes dôkladne premiešajte voda-acetonitrilový extrakt BP.

Extrakcia benzo(a)pyrénu zo vzorky obilia alebo pôdy zmesou acetonitril-voda

Odvážená časť 10 – 25 g vzorky sa prenesie do banky s plochým dnom, pridá sa 50 – 125 cm 3 extraktant A, za prísneho dodržania pomeru 1:5 odváženej časti produktu k objemu extrakčného činidla a miešanie počas 1 hodiny. Filter voda-acetonitrilový extrakt BP cez papierový filter na Buchnerovom lieviku vo vákuu a vytlačte koláč na filtri.

Predčistenie a koncentrácia primárneho extraktu z obilia alebo údeného produktu

Prejdite cez kazetu Diapak A-3 25,0 cm 3 a potom 3 cm3 extraktant A rýchlosťou kvapkania 2-3 kvapky za sekundu do prijímacej banky.

Zozbieraný eluát sa nechá prejsť cez pripravenú náplň Diapak P-3 a potom 5 cm3 acetonitrilu rýchlosťou kvapkania 1 až 2 kvapky za sekundu, pričom premývacie kvapaliny sa vyhodia. Cieľová frakcia obsahujúca BP sa eluuje z patróny zmesou benzén-acetonitril (1:1) v objeme 7 cm3 rýchlosťou 1-2 kvapky za sekundu do stripovacej banky. Eluát sa odparí na rotačnej odparke pri teplote nie vyššej ako 50 °C, do banky sa pridá 0,5 cm3 hexánu a dôkladne sa pretrepáva na mikromiešačke, kým sa suchý zvyšok úplne nerozpustí.

Predčistenie a koncentrácia primárneho pôdneho extraktu

Prejdite cez kazetu Diapak A-3 5,0 cm 3 BP vodno-acetonitrilový extrakt, potom 3 cm3 extraktant A rýchlosťou kvapkania 2-3 kvapky za sekundu do prijímacej banky. Eluát preneste do odmerného valca s objemom 25 cm 3, banku vypláchnite dvoma objemami po 5 cm 3 extraktant A a objem roztoku vo valci upravte na 20 cm3.

Cez pripravenú patrónu Diapak P-3 sa nechá prejsť 5,0 cm3 zriedeného eluátu a potom 5 cm3 acetonitrilu rýchlosťou kvapkania 1-2 kvapky za sekundu, pričom sa premývacie kvapaliny vyhodia. Cieľová frakcia obsahujúca BP sa eluuje z patróny zmesou benzén-acetonitril (1:1) v objeme 7 cm3 rýchlosťou 1-2 kvapky za sekundu do stripovacej banky. Eluát sa odparí na rotačnej odparke pri teplote nie vyššej ako 50 °C, do banky sa pridá 0,5 cm3 hexánu a dôkladne sa pretrepáva na mikromiešačke, kým sa suchý zvyšok úplne nerozpustí.

Jemné čistenie extraktu

Na pripravenú kartušu Diapak C sa samospádom nanesie 0,5 cm 3 roztoku vzorky v hexáne, potom sa banka premyje dvoma dávkami 0,5 cm 3 hexánu a následne sa nanesú na kartušu, pričom všetky premývacie roztoky sa zlikvidujú. BP sa eluuje benzénom v objeme 2,0 cm3 rýchlosťou kvapkania 1-2 kvapky za sekundu do stripovacej banky a odparí sa na rotačnej odparke pri teplote nepresahujúcej 50 °C. Suchý zvyšok extraktu vzorky BP rozpustite v zmesi acetonitril-voda (7:3), ktorej objemy sú uvedené v časti „Podmienky merania“ pre každý variant chromatografického systému (pozri nižšie).

Kalibrácia a meranie

Kalibrácia chromatografu

Chromatograf sa kalibruje postupným zadávaním (v podmienkach merania BP) nominálneho objemu kalibračných roztokov (tabuľka 2) v poradí zvyšovania ich hmotnostných koncentrácií. Každý roztok sa vstrekne do chromatografu aspoň dvakrát. Pri správnom nastavení chromatografického systému musí výška píku v chromatograme kalibračného roztoku s najnižšou koncentráciou presahovať základnú hladinu hluku aspoň 10-krát.

Po matematickom spracovaní chromatogramov sa zaznamenajú retenčné parametre a plochy píkov a vynesú sa do grafu kalibračné charakteristiky (GC), ktoré odrážajú závislosť priemernej hodnoty plochy píku od hmotnostnej koncentrácie BP v kalibračnom roztoku.

Sleduje sa správnosť konštrukcie kalibračnej charakteristiky.

Kalibračná charakteristika sa prestavuje pri výmene stĺpov, po vykonaní údržby a opravy, s negatívnymi výsledkami kontroly stability GC (pozri nižšie).

Stanovenie benzo (a) pyrénu

Podmienky merania (1. možnosť)

Na analýzu sa pripravený extrakt vzorky BP rozpustí v 0,1 cm3 zmesi acetonitril-voda.

Prevádzkové režimy FMD a UVPA sa nastavujú z klávesnice počítača v súlade s užívateľskou príručkou (PAK "MultiChrom-Spectrum") a ovládajú sa na monitoroch v nasledovnej forme:

Fluorometrický detektor

• excitačná vlnová dĺžka 296 nm;
• emisná vlnová dĺžka - svetelný filter č.2 (viac ako 380 nm);
• čas merania 0,2 s.

Automatický dávkovač

• objem regenerácie je 0,4 cm 3;
• objem vzorky 0,04 cm3;
• prietoková rýchlosť 0,15 cm3/min;
• nastavená rýchlosť 0,3 cm 3 / min;
• retenčný čas TK 11 min.
• Zloženie eluentov v nádobách a schéma na vytvorenie gradientu acetonitrilu sú uvedené v tabuľke. 3.

Tabuľka 3 Eluenty

Podmienky merania (2. možnosť)

Na analýzu sa pripravený (pozri vyššie) extrakt vzorky BP rozpustí v 0,5 cm3 zmesi acetonitril-voda.

• filter na budiacej linke - "X4";
• filter emisného vedenia - "ХЗ";
• objem vzorky 0,02 cm3;
• citlivosť je priemerná;
• vyhladenie - 4;
• úroveň "pozadia" sa volí podľa výsledkov registrácie skúšobného chromatogramu kalibračného roztoku č.3.

• prietoková rýchlosť 0,2 cm3/min;
• eluent 84;
• retenčný čas BP je asi 12 min.

Režim separácie gradientu:

• prietoková rýchlosť 0,25 cm3/min;
• eluent 100 v eluente 70 za 20 minút;

Podmienky merania (možnosť 3)

Na analýzu sa pripravený extrakt vzorky BP rozpustí v 0,5 cm3 zmesi acetonitril-voda.

• excitačná vlnová dĺžka 375 nm;
• emisná vlnová dĺžka 405 nm;
• prietoková rýchlosť 0,8 cm3/min;
• objem vzorky 0,02 cm3;
• časová konštanta 1,0 s.

Izokratický separačný režim:

• eluent 84;
• retenčný čas BP je asi 12 minút;

Režim separácie gradientu:

• lineárny gradient od 30 do 70 % eluent 100 v eluente 70 za 20 minút;
• retenčný čas BP je asi 14 min.

Získavanie a spracovanie chromatogramov

Roztok extraktu vzorky sa dvakrát zavedie do chromatografu. Identifikácia BP sa vykonáva na základe porovnania retenčných parametrov píkov v chromatogramoch extraktu vzorky a kalibračných roztokov. Približné retenčné parametre sú uvedené v častiach Podmienky merania. Spoľahlivá identifikácia určovanej zlúčeniny zodpovedá rozdielu medzi hodnotami retenčných parametrov pre kalibračný roztok a vzorku, ktorý nepresahuje 0,2 min.

Riedenie roztoku extraktu

Vykoná sa, ak hmotnostná koncentrácia stanoveného BP prekročí jeho najvyššiu hmotnostnú koncentráciu v kalibračných roztokoch. Roztok extraktu sa zriedi na polovicu (pomer riedenia, dil = 2), pričom sa odoberú rovnaké objemy tohto roztoku a zmesi acetonitril-voda (70:30) a zmieša sa. Ak jediné riedenie neodstráni „mimo stupnicu“, postup sa zopakuje (riediaci pomer, dil = 4).

Spracovanie výsledkov meraní

Vypočítajte priemernú hodnotu plochy píku (výstupný signál z chromatografu) pre dve vstreknutia roztoku extraktu vzorky do chromatografu. Ovládajte konvergenciu výstupných signálov (pozri nižšie).

Kalibračná závislosť slúži na zistenie hodnoty hmotnostnej koncentrácie BP v roztoku, ktorá zodpovedá priemernej hodnote plochy píku.

Hmotnostný podiel BP (I^), mg/kg, v i-tej vzorke (výsledok stanovenia) sa vypočíta podľa vzorca

kde Sbp je hmotnostná koncentrácia analytu v roztoku extraktu i-tej vzorky BP, μg / cm 3 (vypočítaná z kalibračnej závislosti na základe priemernej hodnoty plochy píku); V p- objem roztoku extraktu i-tej vzorky BP, cm 3; R- stupeň extrakcie BP v štádiu prípravy vzorky podľa tabuľky. 2; Meq- hmotnosť časti vzorky zodpovedajúca frakcii vodno-acetonitrilového extraktu BP použitého na čistenie a následné chromatografické stanovenie; - ekvivalentná hmotnosť vzorky, ktorá je 5,0 g (zrno, údené produkty) alebo 0,25 g (pôda).

V prípade riedenia extraktu (pozri vyššie) sa hmotnostný zlomok BP ( W, -, mg / kg) v i-tom meraní sa vypočíta podľa vzorca

kde Wj- hodnota získaná vzorcom (II. 1), dil - stupeň zriedenia (pozri vyššie).

Vypočítajte priemernú hodnotu hmotnostného zlomku TK (výsledok analýzy) pre dve vzorky:

Konvergencia výsledkov stanovenia hmotnostného zlomku BP je kontrolovaná (pozri nižšie).

Registrácia výsledkov merania

Výsledok analýzy (merania) hmotnostného podielu TK v určovanom objekte je prezentovaný vo formulári

kde W - hmotnostný zlomok BP vypočítaný podľa vzorca (II.3).

Ak sa zdroj napájania nenájde, výsledok merania sa zobrazí vo formulári

kde P "ds je prípustný obsah BP podľa tabuľky 1.

Kontrola chýb MVI

Riadenie konvergencie výstupných signálov chromatografu

Kontrola sa vykonáva počas kalibrácie a analýzy každej vzorky vo vzťahu k výstupným signálom (hodnotám plôch píkov BP na chromatogramoch) získaným dvomi vstrekmi roztoku do chromatografu. Výsledok kontroly sa považuje za uspokojivý, ak rozsah výstupných signálov, vztiahnutý na aritmetický priemer, nepresiahne 8 %.

Kontrola správnosti konštrukcie kalibračnej charakteristiky

Kontrola sa vykonáva pri každej kalibrácii. Výsledok kontroly sa považuje za uspokojivý, ak sú splnené podmienky pre každý „-tý kalibračný roztok

kde Sj je priemerná hodnota plochy piku BP pre y"-tý kalibračný roztok, a.u.; S)- hodnota plochy píku zodpovedajúca kalibračnej charakteristike hmotnostnej koncentrácie BP v y "-tom kalibračnom roztoku, c.u.

Kontrola stability kalibračnej charakteristiky

Kontrola sa vykonáva denne pred začatím práce s analyzovanými vzorkami pomocou kontrolného roztoku, ktorý sa používa ako kalibračný roztok s hmotnostnou koncentráciou BP zodpovedajúcou jeho prípustnému obsahu v analyzovanom objekte.

Výsledok kontroly sa považuje za uspokojivý, ak je podmienka

kde C ki je hodnota hmotnostnej koncentrácie BP v kontrolnom roztoku zistená z kalibračnej charakteristiky pre priemernú hodnotu plochy píku, μg / cm 3; C až - hodnota hmotnostnej koncentrácie BP v kontrolnom roztoku podľa tabuľky. 2.

Kontrola konvergencie výsledkov stanovenia

Kontrola sa vykonáva pri každej analýze (meraní). Výsledok kontroly sa považuje za uspokojivý, ak rozsah výsledkov stanovenia, vztiahnutý na aritmetický priemer (výsledok analýzy), nepresahuje 10 %.

Kontrola chýb metódou sčítania

Kontrola sa vykonáva:

• a) pred začatím uplatňovania tohto MVI - bez zlyhania;
• b) keď sa objavia pochybné výsledky stanovenia hmotnostného zlomku BP;
• c) v súlade s plánmi vnútornej laboratórnej kontroly;
• d) na žiadosť organizácií, ktoré kontrolujú činnosť laboratória.

Prísada vzniká na základe kalibračného roztoku. Prídavné množstvo (D, mg / kg) sa volí tak, aby sa hmotnostný zlomok BP vo vzorke zvýšil 1,5 až 2,5 krát. Výpočet sa vykonáva podľa vzorca

kde C D- hmotnostná koncentrácia BP v kalibračnom roztoku, μg / cm 3; Vo- objem kalibračného roztoku BP zavedeného do vzorky, cm 3; M zhv je ekvivalentná hmotnosť vzorky odobratej na analýzu, g.

Prísada sa zavádza do primárneho extraktu vzorky obilia alebo pôdy vo forme kalibračného roztoku pripraveného podľa tabuľky. 2. Prísada sa zavedie do primárneho extraktu údeného produktu vo forme roztoku rovnakej koncentrácie v hexáne. Na tento účel sa GSO zloženia BP v hexáne (pozri vyššie) zriedi (berúc do úvahy korekciu na certifikovanú hodnotu koncentrácie) v súlade s postupom na prípravu kalibračných roztokov (pozri vyššie), použitím hexánu ako rozpúšťadla a získaním roztok požadovanej koncentrácie. Pri použití GSO kompozície BP v acetonitrile sa po odparení rozpúšťadla suchý zvyšok znovu rozpustí v hexáne a zriedi hexánom, ako je opísané vyššie.

Analýza dvoch vzoriek s prirodzeným obsahom BP a dvoch vzoriek s prídavkom BP sa vykonáva za rovnakých podmienok (jedno zariadenie, jedna kalibračná charakteristika, jeden operátor). Výsledok kontroly sa považuje za uspokojivý, ak je podmienka

kde W D- hmotnostný podiel BP vo vzorkách s prísadou, mg / kg; W- hmotnostný zlomok BP vo vzorkách bez aditíva, mg / kg ( W D a W- stredné hodnoty hmotnostného zlomku pre dve vzorky s pozitívnymi výsledkami kontroly konvergencie).

Ilustráciou aplikácie tejto techniky v praktickej ekoanalytike môže byť chromatogram a kalibračný graf na stanovenie benzo(a)pyrénu v potravinách (obrázky 11.15 a 11.16).

Výsledky sledovania chyby stanovenia benzo (a) pyrénu v objektoch adičnou metódou s fluorimetrickou detekciou 375 Ex / 405 Et (možnosť 3).

Úroveň aditíva zodpovedá 0,5 prípustnému obsahu benzopyrénu (0,0005 mg / kg - obilie a údené produkty, 0,01 mg / kg - pôda).

Ryža. 11.15.

Odstupňovanie pre komponent: BaP Korelačný koeficient: 0,999667 Odpoveď: Plocha

Referenčný kanál 365 Ex / 405 Em

Vzorec Y = Ki X

Hodnoty 100 ( W D - W - D) / D sú 10 a 16 % pre vzorky 1 a 2, v tomto poradí. Zlúčenina, ktorá sa má stanoviť v počiatočnej vzorke pšeničnej múky, je prítomná v množstve 0,00009 kg/kg.

Vzorka 1 - 0,00064 mg / kg Vzorka 2 - 0,00067 mg / kg

• Vo všeobecnom prípade má kalibračná charakteristika nasledujúce typy: S = AC + B, kde S je plocha píku, au; C je hmotnostná koncentrácia znečisťujúcej látky, μg / cm3; A a B sú koeficienty.