Свидетельство №30-08 от 04.03.2008
ФР.1.31.2008.01033

1. Объекты исследования

Настоящая методика выполнения измерений распространяется на копченые мясные, копченые рыбные и жировые продукты и устанавливает определение массовой концентрации бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

2. Диапазон измерений

ПДК бенз(а)пирена в жировых, копченых мясных, копченых рыбных продуктах составляет 1 мкг/кг.

Метод обеспечивает получение результатов измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в диапазонах, представленных в таблице 1.

Таблица 1. Диапазоны измерения массовой концентрации бенз(а)пирена

Вид продукции	Диапазон массовой концентрации, мкг/кг	ПДК, мкг/кг
жировые продукты	0,5 – 2,0	1,0
копченые мясные продукты	0,5 – 2,0	1,0
копченые рыбные продукты	0,5 – 2,0	1,0

3. Пробоподготовка

Отбор, консервация и хранение проб продукции проводится в соответствии с ГОСТ 7631, ГОСТ 9792, ТУ и другой нормативной документацией, регламентирующей отбор проб для конкретных видов продукции.

Пробоподготовка состоит из этапов отбора пробы (пробу предварительно охлаждают при температуре минус 12-18 °С в течение 30 мин), измельчения, гомогенизации с натрием сернокислым безводным, экстракции гомогенизированной пробы гексаном в колбе с использованием УЗ-ванны, самопроизвольного осаждения твердого осадка (в течении 1-2 мин), обезжиривания экстракта в морозильной камере (в цилиндр вносят навеску силикагеля, приливают экстракт, содержимое цилиндра помещают в морозильную камеру), очистки надосадочного гексанового слоя методом неудерживающей твердофазной экстракции (на картриджах Strata Silica Si–1)*, отдувки элюата в токе воздуха или инертного газа.

* Примечание. При концентрации жиров исходного анализируемого продукта менее 5%, к исходному экстракту пробы после вымораживания необходимо добавить небольшое количество элюирующего реагента – этилацетата (0,1 мл к 6 мл очищенного экстракта).

4. Проведение хроматографического анализа

4.1. Оборудование и условия для проведения ВЭЖХ-анализа градуировочных растворов бенз(а)пирена, подготовленной пробы продукта.

Для хроматографического анализа бенз(а)пирена необходимо использовать изократическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему с флуориметрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы из ГСО раствора бенз(а)пирена в гексане или из ГСО раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле (растворитель отдувают, перерастворяют стандартный образец в гексане); проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

Оборудование:

хроматограф жидкостный «Стайер» с флуориметрическим детектором;

персональный компьютер с установленным программным обеспечением «МультиХром для Windows XP» версии 1.5 или 2х.

изократический режим;

колонка: Luna С18(2) 150х3,0 мм 3 мкм (Phenomenex, США);

защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);

подвижная фаза: раствор ацетонитрил/вода (75:25);

скорость потока: 0,3 мл/мин;

объем петли: 10 мкл;

температура: 50°С;

диапазон RFU: 0,01;

детектирование: флуориметрическое (λex: 365±2 нм; λem: 400-460 нм).

Градуировку проводят по градуировочным растворам (во всем диапазоне определяемых концентраций) не реже 1 раза в две недели, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок и после ремонта хроматографа.

4.2. Определение количественного содержания бенз(а)пирена в пробе продукта.

Для определения количественного содержания компонента пробы продукта (бенз(а)пирена) проводят хроматографический анализ одного из градуировочных растворов и далее хроматографический анализ подготовленной пробы. Для достоверности измерений хроматографический анализ как градуировочного раствора, так и подготовленной пробы проводят не менее 2 раз подряд.

Используя установленное программное обеспечение – «МультиХром для Windows XP» в отчете или над пиком (в зависимости от установок опций «ВИД») по окончании измерения автоматически определяется результат в виде концентрации в пробе, введенной в хроматограф (но не в исходном образце, взятом для исследования!).

Для получения результата необходимо провести как минимум два параллельных измерения (получить две хроматограммы). За результат измерений принимают среднее арифметическое значение содержания бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы C хр, мкг/л (рассчитывается из двух значений массовой концентрации бенз(а)пирена в концентрате анализируемой пробы С 1 и С 2).
Массовую долю бенз(а)пирена в анализируемой пробе (в исходном образце) Х , мкг/кг рассчитывают по формуле:

где:
С хр – среднее значение концентрации бенз(а)пирена, полученное в результате хроматографирования в двух параллельных измерениях [нг/мл];
V 1 – объем исходного экстракта, фактически равный объему гексана, взятого для первичной экстракции (50 мл);
V 2 – объем экстракта (часть исходного), взятого на вымораживание (30 мл);
V 3 – объем экстракта (часть экстракта после вымораживания), взятого для проведения ТФЭ (6 мл) [мл];
V 5 – объем конечного экстракта, часть из которого вводится в хроматограф (около 3 мл) [мл];
K пробоотбора – коэффициент пробоотбора, учитывающий долю массы пробы продукта (в смеси с сульфатом натрия) взятого для экстракции, от общей массы пробы, взятой на анализ. Во всех случаях равен 0,736;
K вымораживания – коэффициент потерь бенз(а)пирена при вымораживании. Для всех категорий исследуемых продуктов этот коэффициент одинаков и равен 0.95;
K экстр.1 – коэффициент первичной жидкостной экстракции гексаном. Для всех категорий исследуемых продуктов одинаков и равен 0.95;
K ТФЭэкстр.2 – коэффициент твердофазной экстракции бенз(а)пирена, равен 0,95;
m пр. – почвы или грунта, взятой на анализ [г].

стр. 1

стр. 2

стр. 3

стр. 4

стр. 5

стр. 6

стр. 7

стр. 8

стр. 9

стр. 10

стр. 11

стр. 12

стр. 13

стр. 14

стр. 15

стр. 16

стр. 17

стр. 18

стр. 19

ГОСТ 24104 .

Испаритель ротационный ИР-1М.

ГОСТ 25336 .

Баня водяная.

Мешалка магнитная типа ММ-ЗМ с электроподогревом.

Осветитель ультрафиолетовый типа «Хроматоскоп» со спектральным диапазоном 250 - 700 нм и лампой типа БУВ-15 в качестве источника УФ-излучения.

Камера хроматографическая стеклянная 40 х 40 х 40 см.

Пластинки стеклянные для тонкослойной хроматографии 5 х 20 и 20 х 20 см.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 500 мм и диаметром 20 мм с оттянутым внизу концом и резервуаром вместимостью 50 - 60 см 3 ПШ 14/23.

Холодильник ХПТ-2-400-29/32 ХС или ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .

Алонж типа АИО-14/23-50 ТС или АИО-14/23-14/23-65 ТС по ГОСТ 25336 .

Линейка измерительная с ценой деления 0,1 см по ГОСТ 427 .

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или 300-19/26-29/32 по ГОСТ 25336 .

Насадка П-1-19/26-14/23-14/23 ТС или Н-2-19/26-14/23 ТС по ГОСТ 25336 .

ГОСТ 25336 .

ГОСТ 25336 . Цилиндры мерные 1-100, 1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 25336 .

Стакан химический В-1-100 или В-1-150 по ГОСТ 25336 .

Колбы К-1-100-29/32 ТХС, К-1-25Р-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336 .

Воронка Бюхнера 1 или 2, или 3 по ГОСТ 9147 .

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ-34/12 по ГОСТ 25336 .

Микрошприцы типов МШ-10, стеклянные капилляры.

Бумага индикаторная универсальная.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .

Скальпель или тонкий шпатель.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 .

Ацетонитрил по нормативному документу .

Целлюлоза микрокристаллическая порошковая по нормативному документу .

ГОСТ Р 51650-2000

Бенз(в)хризен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Сефадекс LH-20.

Силикагель марки АСКГ по нормативному документу .

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.2 Подготовка к испытанию

5.2.1 Подготовка растворителей

Растворители (н.гексан, этиловый спирт, ацетон, бензол) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

Диметилформамид перегоняют, добавив в перегонную колбу 120 см 3 бензола и 36 см 3 воды на 1 дм 3 растворителя.

5.2.2 Приготовление ацетилированной целлюлозы

(50,0±2,0) г микрокристаллической целлюлозы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см 3 , добавляют приготовленную в отдельной колбе смесь 150 см 3 бензола или толуола, 70 см 3 уксусного ангидрида и 0,3 см 3 серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают магнитной мешалкой в течение 6 - 8 ч, оставляют без перемешивания еще на 18 ч, после чего декантируют жидкую фазу, а остаток заливают 300 см 3 этилового спирта, перемешивают, оставляют в спирте на 24 ч, затем целлюлозу отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 100 см 3 этилового спирта и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге).

Затем проверяют хроматографическую активность ацетилированной целлюлозы. Для этого за 3 - 4 ч до проведения анализа готовят смесь этилового спирта, ацетона и воды, взятых в объемном отношении 60:25:15, и выливают ее в выстланную полосками фильтровальной бумаги хроматографическую камеру. Высота слоя растворителя должна составлять 1,5 - 2 см. 1,5г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 7 см 3 этилового спирта и выливают суспензию ровным слоем на стеклянную пластину 5 х 20 см, дают растворителю полностью испариться на воздухе и наносят на пластинку микрошприцем или стеклянным капилляром в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см 3 . Пластину помещают в хроматографическую камеру и оставляют в камере до тех пор, пока уровень растворителя поднимется не менее, чем на 100 мм от линии старта. По окончании хроматографии пластину вынимают, высушивают на воздухе и под лампой ультрафиолетового облучателя отмечают флуоресцирующее голубым цветом пятно бенз(а)пирена. Измеряют расстояние от стартовой линии до фронта растворителя и до середины пятна бенз(а)пирена; рассчитывают значение Rj, оценивающую скорость перемещения бенз(а)пирена по пластинке, по формуле:

где Х БП - расстояние от стартовой линии до середины пятна бенз(а)пирена, мм;

L - расстояние от стартовой линии до фронта растворителя, мм.

Значение Rj бенз(а)пирена должно составлять 0,1.

Для приготовления рабочей пластины 5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 20 см 3 этилового спирта и выливают ровным слоем на пластину 20x20 см.

5.2.3 Приготовление стандартных растворов бенз(а)пирена и бенз(в)хризена

В стаканчики для взвешивания (бюксы) отвешивают по (10,0+0,2) мг бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Навески количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см 3: бенз(а)пирен-бензолом, бенз(в)хризен-ацетонитрилом, затем объем раствора бенз(а)пирена доводят до метки бензолом, объем раствора бенз(в)хризена-ацетонитрилом. Полученные растворы имеют массовую концентрацию 100 мкг/см 3 . Растворы хранят в холодном темном месте не более трех месяцев.

5.2.4 Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена и бенз(в)хризена

Рабочие растворы готовят разведением стандартных растворов, используя пипетки вместимостью 1, 5 и 10 см 3 и мерные колбы вместимостью 100 см 3 , объем раствора доводят до метки соответствующим растворителем, перемешивают и хранят в холодном темном месте не более одного месяца.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1,0 мкг/см 3 (для определения методом спектрофлуориметрии): из стандартного раствора отбирают 1,0 см 3 и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 ; объем раствора доводят до метки бензолом.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25: 1,0 и 5,0 мкг/см 3 (для определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии): из стандартного раствора отбирают 0,25; 1,0; 5,0 см 3 , соответственно, и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см 3 ; объем растворов доводят до метки ацетонитрилом.

Приготовление растворов бенз(в)хризена массовой концентрации 0,5 и 10 мкг/см 3: из стандартного раствора отбирают 0,5 и 10 см 3 , соответственно, и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см 3 ; объем каждого раствора доводят до метки ацетонитрилом.

5.2.5 Приготовление градуировочных растворов

Для приготовления градуировочных растворов смеси бенз(а)пирена и бенз(в)хризена в мерные колбы вместимостью 250 см 3 пипеткой вместимостью 1 см 3 переносят приведенные в таблице 2 объемы стандартного раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см 3 и рабочего раствора бенз(в)хризена массовой концентрации 10 мкг/см 3 , доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученные растворы перемешивают и хранят в темном холодном месте не более одного месяца.

Таблица 2

раствора Объем исходного раствора, см 3 Массовая концентрация в градуировочном растворе, мкг/см 3 Бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см 3 Бенз(в)хризена массовой концентрации 10 мкг/см 3 Бенз(а)пирена Бенз(в)хризена

5.3 Проведение испытания

5.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную колбу или плоскодонную вместимостью 100 см 3 помещают навеску продукта массой 10 г, добавляют раствор, состоящий из 4 г гидроокиси калия в 50 см 3 92 %-ного этилового спирта. Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане или на магнитной мешалке при кипении реакционной смеси в течение 3 ч. Затем в колбу через холодильник добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения реакционную массу переносят в делительную воронку вместимостью 500 см 3 . В случае, если после гидролиза в реакционной массе остался твердый остаток, его отделяют на воронке Бюхнера, промывая остаток на фильтре 30 см 3 горячего этилового спирта. Жидкую фазу реакционной массы используют для экстракции. В делительную воронку добавляют 30 см 3 н.гексана. Содержимое воронки встряхивают и оставляют для расслаивания жидкостей. В случае образования эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см 3 этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают в колбу, а гексановый экстракт переливают в другую делительную воронку. Такую обработку реакционной массы проводят еще два раза, используя для экстракции н.гексан по 30 см 3 и этиловый спирт для расслаивания эмульсии порциями по 20 см 3 .

По окончании экстракции объединенный гексановый экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 30 см 3 , переносят экстракт в круглодонную колбу вместимостью 100 см 3 , фильтруя через слой безводного сульфата натрия на воронке с пористым фильтром. Раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 50 см 3 при температуре водяной бани не выше 60 °С.

Упаренный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 500 см 3 и добавляют к нему 50 см 3 смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении 9:1. Интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин, после расслаивания фаз нижнюю сливают в плоскодонную колбу вместимостью 200 см 3 , а из верхнего гексанового слоя снова проводят экстракцию 50 см 3 смеси диметилформамида и воды. Гексановый слой отбрасывают, объединенный в плоскодонной колбе диметилформамидный экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 100 см 3 дистиллированной воды и проводят экстракцию из водной фазы гексаном трижды по 50 см 3 . Водную фазу отбрасывают, а гексановый экстракт промывают водой трижды по 30 см 3 , переносят в плоскодонную колбу, добавляют 10 г безводного сульфата натрия и выдерживают в течение одного часа, н.гексан упаривают на ротационном испарителе до объема 1,5 - 2,0 см 3 , оставшийся растворитель удаляют

ГОСТ Р 51650-2000

потоком воздуха через вакуумный алонж, соединенный с водоструйным насосом, остаток в колбе растворяют в 0,5 см 3 этилового спирта.

В стакан вместимостью 100 см 3 отвешивают (2,5 ± 0,2) г сефадекса LH-20, добавляют 20 см 3 этилового спирта и оставляют для набухания на 3 - 4 ч. Затем гель переносят, смывая небольшим количеством спирта, в стеклянную хроматографическую колонку, дают растворителю стечь таким образом, чтобы слой спирта над слоем сорбента оставался не ниже 2 мм. На подготовленную колонку наносят пипеткой остаток экстракта из колбы, трижды смывая его из колбы этиловым спиртом порциями по 0,5 см 3 . Элюирование из колонки полициклических ароматических углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, проводят 40 см 3 этилового спирта, первую фракцию объемом 12 см 3 отбрасывают, собирают вторую фракцию объемом 25 см 3 . Скорость элюирования растворителя 0,5 см 3 /мин обеспечивают, создавая небольшое избыточное давление потоком воздуха или азота через насадку, соединенную с воздуходувкой или газовым баллоном. Газ следует подавать через стеклянную трубку, заполненную силикагелем.

Колонку с сефадексом LH-20 можно использовать многократно. Для этого, не допуская высыхания сорбента после фракционирования, колонку промывают 25 см 3 этилового спирта и наносят следующую пробу.

Раствор второй фракции переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 см 3 , растворитель упаривают до объема 0,5 - 1,0 см 3 , его остаток удаляют в потоке воздуха или азота.

Полученную фракцию, содержащую бенз(а)пирен, далее анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или спектрофлуориметрическим методом.

Одновременно проводят контрольный опыт, проводя все стадии анализа с использованием реактивов согласно методике, но без навески продукта.

5.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.3.2.1 Условия хроматографии

Условия хроматографии подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.

В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения бенз(а)пирена.

Жидкостный хроматограф «АИех-334» с флуоресцентным детектором «Kratos FS-970».

Колонка Supelcosil LC-PAM зернением 5 мк, длиной 150 мм, диаметром - 4,6 мм.

Флуориметрический детектор: длина волны возбуждающего света 300 нм, эмиссионный фильтр - 418 нм.

Подвижная фаза: ацетонитрил и вода в объемном соотношении 8:2.

Скорость элюирования - 2,0 см 3 /мин.

Объем вводимой пробы - 20 мкл.

Чувствительность усилителя подбирают таким образом, чтобы интенсивность сигналов бенз(а)пирена и внутреннего стандарта - бенз(в)хризена не превышала 95 % шкалы.

Время анализа - 15 мин; время удерживания бенз(а)пирена - 5 мин, бенз(в)хризена -13 мин.

Анализируемые растворы хроматографируют дважды в одинаковых условиях. Площади пиков измеряют с помощью интегратора или вручную как произведение высоты пика и его ширины на половине высоты.

Определение содержания бенз(а)пирена проводят методом внутреннего стандарта или методом добавок.

5.3.2.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 5.3.1, методом внутреннего стандарта

При использовании такого способа количественной оценки предварительно проводят градуировку хроматографа, используя градуировочные растворы, приготовленные по 5.2.5.

В условиях, указанных в 5.3.2.1, записывают по три хроматограммы для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Определяют среднеарифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена, рассчитанное из трех хроматограмм.

Градуировочный коэффициент К вычисляют по формуле

где и и 2 - массы введенных в хроматограф бенз(а)пирена (/л]) и бенз(в)хризена (т 2),мкг; 5) и ^2 - площади пиков бенз(а)пирена (.9])и бенз(в)хризена (Л^), см 3 .

Градуировочный коэффициент К рассчитывают для каждого раствора.

Его значения не должны отличаться от среднеарифметического значения градуировочного коэффициента из всех результатов более чем на 10 %.

При длине волны возбуждающего света 300 нм и эмиссионном фильтре 418 нм значение градуировочного коэффициента составляет 9,5.

Перед началом анализа на стадии подготовки проб к щелочному гидролизу в пробу продукта и пробу контрольного опыта вносят по 50 мкл раствора бенз(в)хризена массовой концентрации 0,5 мкг/см 3 . Обе пробы проводят через все стадии испытания, указанные в 5.3.1. Сухой остаток растворяют в 200 мкл ацетонитрила.

В условиях, указанных в 5.3.2.1, записывают хроматограммы раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см 3 и раствора бенз(в)хризена массовой концентрации 100 мкг/см 3 , отмечают время выхода бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Затем записывают хроматограммы пробы контрольного опыта с добавкой бенз(в)хризена и пробы продукта с такой же добавкой бенз(в)хризена. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена на хроматограммах пробы продукта и пробы контрольного опыта.

Для каждой пробы записывают по две хроматограммы. Из двух хроматограмм рассчитывают среднеарифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта т\ и пробе контрольного опыта т 2 .

«72 - масса бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мкг; т ст - масса бенз(в)хризена, введенного в пробу продукта и пробу контрольного опыта, мкг;

S"] и S 2 - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы продукта (.S"]) и пробы контрольного опыта (.S/), см 2 ;

Л/, Л/ - площади пиков бенз(в)хризена на хроматограммах пробы продукта (.SS) и пробы контрольного опыта (Л/), см 2 ;

К- градуировочный коэффициент, установленный по 5.3.2.2.

5.3.2.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 5.3.1, методом добавок

Для количественной оценки при использовании метода добавок одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта. Фракции, выделенные из проб продукта и контрольного опыта по 5.3.1, растворяют в 400 мкл ацетонитрила. Полученные растворы делят на две части, отбирая меньшую часть (40 мкл) в пробирку или грушевидную колбу.

Записывают хроматограммы пробы продукта, пробы контрольного опыта и хроматограмму раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25 мкг/см 3 . Отмечают время выхода бенз(а)пирена.

В оставшиеся части пробы продукта и контрольного опыта (360 мкл) делают добавку 10 - 20 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 5 мкг/см 3 . Полученные растворы вновь вводят в хроматограф.

Все хроматограммы записывают дважды. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена. Из двух хроматограмм рассчитывают среднеарифметическое значение площади пика бенз(а)пирена.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта /77] и пробе контрольного опыта т 2:

т оп ■ S 1 . _ т к ■ S 3 (9)

S 2 - 0,95) ’ 2 5 4 - 0,95 3 ’

где /77 оп и /77 k - масса бенз(а)пирена, добавленная к части экстракта из пробы продукта (т оп) и пробы контрольного опыта (/%), мкг;

S"] и S 2 - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы продукта (.S"]) и пробы продукта с добавкой бенз(а)пирена (Л/), см 2 ;

Л/ и.S) - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы контрольного опыта (Л/) и пробы контрольного опыта с добавкой бенз(а)пирена (Л/), см 2 ;

0,9 - доля пробы, к которой делают добавку бенз(а)пирена.

5.3.3 Определение содержания бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре

При определении содержания бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта, в которую добавлено 50 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см 3 .

Полученные по 5.3.1 фракции, содержащие бенз(а)пирен, из пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой, растворяют в 0,5 см 3 бензола и далее подвергают дополнительной очистке в тонком слое ацетилированной целлюлозы.

Для этого пластинку 20 х 20 см, подготовленную, как указано в 5.2.2, делят на два поля: боковое- шириной 1,5 - 2 см и основное, проводя по слою сорбента скальпелем или тонким шпателем разделительную полосу. На основное поле сплошной полосой, отступив 2 см от нижнего края пластинки и по 1 см с боковых краев, наносят раствор фракции, выделенной по 5.3.1. Раствор наносят с помощью тонко оттянутого капилляра или микрошприца, размер пятен не должен превышать 5 мм. Для количественного переноса вещества его дважды смывают со стенок колбы небольшим количеством бензола (0,4 - 0,6 см 3). На стартовую линию бокового поля наносят в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см 3 . После полного испарения растворителя пластинку помещают в предварительно насыщенную хроматографическую камеру под углом 70° - 85° и проводят элюирование в смеси этилового спирта, ацетона и воды, взятых в соотношении 60:25:15. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее вынимают из камеры, высушивают на воздухе и проявляют хроматографическую зону бенз(а)пирена под лампой ультрафиолетового облучателя. Сорбент из зоны бенз(а)пирена с основного поля с помощью скальпеля или тонкого шпателя соскабливают с пластинки и переносят на стеклянный фильтр, с которого вещество элюируют в несколько приемов 50 см 3 бензола в колбы вместимостью 100 см 3 , далее растворитель упаривают до небольшого объема, остаток растворителя удаляют потоком воздуха и добавляют в колбу 1 см 3 бензола.

На спектрофлуориметре при длине волны возбуждающего света 386 нм в диапазоне 400 - 440 нм при скорости сканирования 60 нм/мин записывают спектры флуоресценции пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой бенз(а)пирена.

Спектры растворов записывают в одном режиме усиления, регулируя щель и коэффициент усиления по раствору контрольной пробы так, чтобы сигнал бенз(а)пирена при 406 нм составлял 0,4 - 0,6 шкалы прибора. Для каждого раствора спектр записывают дважды, добиваясь хорошей воспроизводимости. На полученных спектрограммах в максимуме при 406 нм измеряют в миллиметрах высоту спектральной линии бенз(а)пирена для пробы продукта и пробы контрольного опыта. Рассчитывают среднее значение высот бенз(а)пирена по данным двух спектрограмм. При высоких уровнях содержания бенз(а)пирена в продукте пробы разбавляют бензолом и вновь записывают спектр в том же режиме усиления, что и для контрольной пробы.

Проводят два параллельных определения.

5.4 Обработка результатов

5.4.1 Массовую долю бенз(а)пирена в продукте Х\,%, или Х 2 , мг/кг, при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии вычисляют по формулам:

{т 1 - т 2) ■ 100 {т г - т 2) т ■ 1000 1000 “ т 10

где mi - масса бенз(а)пирена в пробе продукта, мкг;

m2 - масса бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мкг; т - масса продукта, взятая для анализа, г.

5.4.2 Массовую долю бенз(а)пирена в продукте А), %, или Х 2 , мг/кг, при использовании метода спектрофлуориметрии вычисляют по формулам:

С ст НУ- 100 с СТ // V т ■ 1000 ■ 1000 ■

где с ст - массовая концентрация бенз(а)пирена в рабочем растворе, приготовленного по 5.2.4 и добавленного в пробу контрольного опыта, мкг/см 3 ;

высота спектральной линии бенз(а)пирена на спектрограмме пробы продукта, мм; высота спектральной линии бенз(а)пирена на спектрограмме пробы контрольного опыта, мм;

V- объем рабочего раствора бенз(а)пирена, добавленного в пробу контрольного опыта, см 3 ; т - масса навески продукта, взятого для испытания, г.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое двух параллельных определений с тем же числом значащих цифр.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает \Х-у - ЙГ 2 | <

< 0,01 dX, где, Х 2 и X- результаты параллельных определений и их среднее арифметическое, а d - норматив контроля сходимости, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива d приведено в таблице 3.

По полученному результату анализа X и значению относительной погрешности д, приведенной в таблице 3, рассчитывают абсолютную погрешность А = 0,(ШХ

Результат анализа представляют в виде (X± А), мг/кг или % при Р = 0,95.

5.5 Контроль точности результатов анализа

5.5.1 Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 5.3.

5.5.2 Для проведения контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой в разных лабораториях или в одной лаборатории, максимально варьируя условия проведения анализа, т. е используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов признают удовлетворительной, если \Х-у - Х 2 \ <

< 0,01 DX, где Л), Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднее арифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 3.

Периодичность проведения контроля воспроизводимости - не реже одного раза в две недели

Таблица 3 - Диапазон измерений, значение характеристики относительной погрешности и нормативы оперативного контроля случайной составляющей относительной погрешности (сходимости и воспроизводимости) при доверительной вероятности Р = 0,95

5.5.3 Для проведения контроля точности используют рабочие пробы с известной добавкой бенз(а)пирена. Пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку бенз(а)пирена и затем также анализируют в соответствии с методикой. Величина добавки должна составлять 50 - 150 % содержания бензапирена в анализируемой пробе.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если |Л) - X- с \ < К, где Л), X и с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена соответственно; К - норматив оперативного контроля точности.

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» - тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6

ГОСТ Р 51650-2000

1 Область применения........................................................ 1

3 Отбор проб............................................................... 2

4 Метод низкотемпературной спектрофлуориметрии................................. 2

4.1 Аппаратура, материалы и реактивы.......................................... 2

4.2 Подготовка к испытанию................................................. 3

4.3 Проведение испытания................................................... 3

4.4 Обработка результатов................................................... 6

4.5 Контроль точности результатов анализа...................................... 6

5 Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при

комнатной температуре...................................................... 7

5.1 Аппаратура, материалы и реактивы.......................................... 8

5.2 Подготовка к испытанию................................................. 9

5.3 Проведение испытания...................................................10

5.4 Обработка результатов...................................................13

5.5 Контроль точности результатов анализа......................................14

6 Требования техники безопасности..............................................15

7 Требования к квалификации оператора..........................................15

Приложение А Библиография

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Методы определения массовой доли бенз(а)пирена

Methods for determination of benz(a)pyren fraction of total mass

Дата введения 2001-07-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продовольственное сырье, пищевые продукты, пищевые и вкусовые добавки и устанавливает методы определения массовой доли бенз(а)пирена с применением спектрофлуориметрии при низкой и комнатной температуре и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104 .

Испаритель ротационный ИР-1М.

Баня водяная.

Электроплитка бытовая с закрытой спиралью и регулятором нагревания по ГОСТ 14919 .

Сосуд Дьюара для жидкого азота любой вместимости

Ванны для хроматографирования (фотокюветы эмалированные).

Пластины стеклянные размером 15 х 30 и 20 х 40 см.

Колбы К-1-250-29/32 ТХС, К-1-100-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336 .

Холодильники ХИТ-1-300-14/23 ХС или ХИТ-1-400-14/23 ХС по ГОСТ 25336 .

Холодильники ХПТ-2-400-29/32 ХС и ХПТ-1-300-29/32 или ХПТ-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или дефлегматор 300-19/26-29/32 ТС по ГОСТ 25336 .

Пробирки стеклянные П2-10-180 ХС по ГОСТ 25336 .

Насадка П-1-19/26-14/23 ТС или Н2-19/23 по ГОСТ 25336 .

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336 .

Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см 3 по ГОСТ 29228 и ГОСТ 29229 .

Воронка ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336 .

Пробирки мерные П-2-15-14/23 ХС по ГОСТ 1770 .

Воронка делительная ВД-1-500 или ВД-3-500 по ГОСТ 25336 .

Цилиндры мерные 1-100, 1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 25336 .

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8, или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ-34/12 по ГОСТ 25336 .

Термометр с пределами измерения температуры 0-250 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 29224 .

Капилляры стеклянные, палочки стеклянные.

н.октан, ч., по нормативному документу .

н.гексан, ч., по нормативному документу .

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 или спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652 .

Эфир петролейный фракция 40 - 70 °С по нормативному документу .

Алюминия окись для хроматографии 2 степени активности по нормативному документу .

Бенз(а)пирен, содержание основного вещества не менее 98 %.

1,12-Бензперилен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных.

4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1 Очистка растворителей

Растворители (н.октан, этиловый спирт, петролейный эфир, хлороформ и н.гексан) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

4.2.2 Подготовка окиси алюминия

Окись алюминия высушивают в сушильном шкафу при температуре (250+4) °С в течение 4 ч и хранят в сосуде с пришлифованной пробкой.

4.2.3 Приготовление раствора бенз(а)пирена для тонкослойной хроматографии (раствор «свидетель») .

В бюксу отвешивают около 10 мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров петролей-ного эфира до полного растворения взятой навески.

Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят объем раствора до метки петролейным эфиром. Срок хранения раствора не более трех месяцев в холодильнике.

4.2.4 Приготовление стандартного раствора бенз(а)пирена

В бюксу отвешивают (10,0 ± 0,2) мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров н.октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см 3 и доводят до метки н.октаном. Массовая концентрация бенз(а)пирена в полученном растворе 100 мкг/см 3 . Раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора не более трех месяцев.

4.2.5 Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена

Рабочие растворы бенз(а)пирена массовой концентрации 0,1; 0,04 и 0,02 мкг/см 3 в н.октане готовят последовательным разведением исходного стандартного раствора бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.4, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см 3 . Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

4.2.6 Приготовление стандартного раствора 1,12-бензперилена (внутренний стандарт)

Для приготовления исходного раствора в бюксу отвешивают (10,0+0,2) мг 1,12-бензперилена, приливают несколько миллилитров н.октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см 3 и доводят до метки н.октаном. Массовая концентрация 1,12-бензперилена в полученном растворе 100 мкг/см 3 . Раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора не более трех месяцев.

4.2.7 Приготовление рабочих растворов 1,12-бензперилена (растворы внутреннего стандарта)

Рабочие растворы 1,12-бензперилена массовой концентрации 0,01; 0,005; 0,002 и 0,001 мкг/см 3

готовят в н.октане последовательным разведением исходного стандартного раствора, приготовленного по 4.2.6, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см 3 . Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

4.3 Проведение испытания

4.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную колбу вместимостью 500 см 3 помещают навеску продукта массой 25 г, добавляют в колбу 20 см 3 дистиллированной воды, 200 см 3 этилового спирта и 20 г гидроокиси калия.

Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при кипении реакционной смеси в течение 3 ч. Затем в колбу через холодильник добавляют 150 см 3 воды; колбу снимают с бани и охлаждают до комнатной температуры.

После охлаждения жидкую фазу реакционной смеси декантацией переносят в делительную воронку, оставляя остаток продукта в колбе. В колбу с остатком добавляют 150 см 3 н.гексана, содержимое колбы энергично перемешивают и н.гексан декантируют в делительную воронку.

Воронку закрывают пробкой и энергично встряхивают, затем закрепляют в штативе и оставляют для расслаивания жидкостей. Для разделения образовавшейся эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см 3 этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают обратно в колбу с осадком, а гексановый экстракт переливают в колбу вместимостью 500 см 3 .

Такую обработку реакционной смеси проводят еще два раза, используя для экстракции н.гексан по 100 см 3 и этиловый спирт для расслаивания эмульсии, порциями по 20 см 3 .

По окончании экстракции остаток в колбе и гидролизат отбрасывают, а экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 50 см 3 и упаривают порциями в предварительно взвешенной с точностью до второго знака после запятой круглодонной колбе вместимостью 250 см 3 на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С. Колбу с экстрактом оставляют в вытяжном шкафу для удаления следов растворителя, после чего вновь взвешивают. По разности между взвешиваниями определяют массу выделенного экстракта.

От экстракта в колбе отбирают 1 /5 часть в бюксу, не взвешивая. Колбу с остатком экстракта взвешивают. В бюксу с частью экстракта добавляют 0,1-0,2 см 3 раствора «свидетеля» бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.3. Содержимое бюксы и остаток в колбе растворяют в небольшом объеме петролейного эфира.

Для хроматографического разделения экстракта на стеклянную пластину размером 20x40 см равномерно насыпают окись алюминия. Затем с помощью стеклянной палочки, разделенной на три части (14, 1 и 3 см) резиновыми колечками толщиной 1 мм и шириной 3 мм, тщательно разравнивают окись алюминия.

Полученные растворы количественно наносят на подготовленную пластину стеклянными капиллярами: на узкую часть - раствор из бюксы («свидетель»), на широкую - экстракт продукта из колбы. Растворы наносят равномерно сплошной полосой, отступив от нижнего края пластины 7 - 8 см.

Пластину помещают в ванну для хроматографирования под небольшим 20° - 25° углом, наливают петролейный эфир так, чтобы он не доходил до линии нанесения пробы. Ванну накрывают стеклом и проводят хроматографию, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины.

Не высушивая пластину, облучают ее ультрафиолетовым светом и по светящейся полосе «свидетеля» определяют место нахождения бенз(а)пирена в исследуемой пробе. Отмечают границы полосы бенз(а)пирена на хроматограмме исследуемой пробы. Пластину высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Отмеченную на хроматограмме исследуемой пробы полоску окиси алюминия с помощью предметного стекла снимают с пластины и количественно переносят на пористую пластину фильтрующей воронки. Воронку соединяют с круглодонной колбой вместимостью 100 см 3 и бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия 50 см 3 бензола, добавляя бензол небольшими порциями и перемешивая окись алюминия на воронке палочкой. Бензол упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С. Остаток в колбе октаном количественно переносят в пробирку. Объем раствора в пробирке не должен превышать 5 см 3 .

При анализе некоторых продуктов не происходит полного и четкого разделения флуоресцирующих компонентов образца при первичном хроматографировании выделенного из продукта экстракта. В этом случае на пластине выделяют более широкую полоску окиси алюминия на уровне «свидетеля»; бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия бензолом так, как описано выше, и остаток после упаривания растворяют в этиловом спирте и полученный спиртовой экстракт повторно хроматографируют.

Для хроматографического разделения спиртового экстракта используют пластину размером 15 х 30 см толщиной слоя окиси алюминия 0,3 мм. На пластине отделяют две полосы шириной 10 и 3 см. На широкую часть пластины наносят с помощью стеклянного капилляра спиртовой экстракт анализируемого продукта, на узкую - раствор бенз(а)пирена в петролейном эфире (раствор «свидетель»), Пластину помещают в ванну под углом 20 - 25° и проводят хроматографию в хлороформе, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины. В ультрафиолетовом свете отмечают по «свидетелю» полосу окиси алюминия с бенз(а)пиреном исследуемого продукта. Затем бенз(а)пирен элюируют с окиси алюминия бензолом и проводят все дальнейшие операции так, как указано выше.

ГОСТ Р 51650-2000

Раствор бенз(а)пирена в н.октане переносят в пробирку. Объем раствора не должен превышать 5 см 3 при исходной навеске продукта 25 г.

В полученном растворе (экстракте) определяют содержание бенз(а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии, используя для количественной оценки метод добавок или метод внутреннего стандарта.

4.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 4.3.1, методом добавок.

В три пробирки наливают пипеткой по 1 см 3 полученного раствора бенз(а)пирена в н.октане. Затем в первую пробирку приливают 2 см 3 н.октана. Во вторую пробирку приливают 1,5 см 3 н.октана и 0,5 см 3 рабочего раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,1 мкг/см 3 , приготовленного по 4.2.5. В третью пробирку вносят 1 см 3 н.октана и 1 см 3 того же рабочего раствора бенз(а)пирена, что и во вторую пробирку.

Спектрофлуориметрический анализ начинают с третьей пробирки. Для этого третью пробирку помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра; устанавливают аналитическую линию флуоресценции бенз(а)пирена 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм. Регулировкой коэффициента усиления и раскрытием щели, а также одновременной юстировкой пробирки в сосуде Дьюара добиваются максимального сигнала по регистрирующему прибору спектрофотометра (до 50 - 80 %), после чего записывают спектрограмму бенз(а)пирена в области 401 - 404 нм, фиксируя значение регистрирующего прибора спектрофотометра при длине волны 401 нм. Запись спектра повторяют дважды.

Затем последовательно замораживают в жидком азоте вторую и первую пробирки и записывают спектры флуоресценции в области длин волн 401 - 404 нм, обязательно выставляя перо самописца при длине волны 401 нм в то же положение, что при сканировании пробы в третьей пробирке.

Массовую концентрацию бенз(а)пирена в анализируемом экстракте определяют по графику, на котором по оси абсцисс откладывают значение добавки бенз(а)пирена (мкг), а по оси ординат - высоту пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм, измеренную по полученным спектрограммам в миллиметрах.

Если массовая концентрация бенз(а)пирена в исследуемом растворе попадает в область, пригодную для измерений, то полученные экспериментальные точки лежат на одной прямой. Экстраполяция этой прямой до пересечения с осью абсцисс дает на ней отрезок, соответствующий содержанию бенз(а)пирена в растворе без добавки, т. е в 1 см 3 исследуемого раствора. В случае, если массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемом растворе выше верхнего предела диапазона измеряемых прибором концентраций, то проводят разбавление анализируемого раствора н.октаном.

4.3.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 4.3.1, методом внутреннего стандарта

В качестве внутреннего стандарта используют 1,12-бензперилен. В пробирку наливают 3 см 3 раствора бенз(а)пирена в н.октане, полученного по 4.3.1, и помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра, устанавливают аналитическую линию 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм и проводят запись спектра раствора в области длин волн 401 - 409 нм. По интенсивности линии (по высоте пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм) оценивают приблизительное содержание бенз(а)пирена в пробе. В соответствии с этой оценкой далее в пробирку с 3 см 3 раствора бенз(а)пирена в н.октане добавляют раствор 1,12-бензперилена в таком количестве, чтобы в спектре пробы интенсивность 1,12-бензперилена при

406.3 нм была в 3 - 5 раз больше интенсивности линии бенз(а)пирена при длине волны 403 нм.

Проводят запись спектра в интервале длин волн 401 - 409 нм дважды.

Интенсивности характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при

406.3 нм (Н| и Н 2 соответственно) определяют по спектрограммам, измеряя высоты пиков в максимумах характеристических линий этих соединений в миллиметрах. В расчетах принимают среднюю величину. Рассчитывают коэффициент отношения (К) интенсивности линии бенз(а)пире-на (ЕГД к интенсивности линии 1,12-бензперилена (ЕГ 2), К = //]/// 2 .

Далее определяют этот коэффициент для стандартных растворов бенз(а)пирена (Х ст). Для этого в две пробирки наливают по 3 см 3 стандартных растворов бенз(а)пирена с массовой концентрацией 0,02 и 0,04 мкг/см 3 . В каждую из пробирок наливают такое же количество 1,12-бензперилена, что и в пробирку с пробой. Проводят дважды запись спектров каждого раствора в интервале длин волн 401 - 409 нм.

При этом обязательно следят за тем, чтобы положение пера самописца при длине волны 401 нм во всех случаях фиксировалось на одном уровне.

Далее по спектрограммам определяют интенсивность характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при 406,3 нм (Щ и Н 2 соответственно). В расчетах принимают среднее значение. Рассчитывают К ст = Н^Н 2 для каждой концентрации бенз(а)пирена.

Массовую концентрацию бенз(а)пирена в анализируемом растворе с, мкг/см 3 , вычисляют по формуле:

с с ст *К/К ст, (1)

где с ст - концентрация бенз(а)пирена в стандартном растворе, мкг/см 3 ;

К- коэффициент, найденный по спектрограмме анализируемого раствора с добавкой 1,12-бензперилена;

К С1 - коэффициент, найденный по спектрограммам стандартного раствора бенз(а)пирена с добавкой 1,12-бензперилена, значение которого ближе по значению к коэффициенту анализируемого раствора с соответствующей добавкой 1,12-бензперилена.

Проводят два параллельных определения и одновременно контрольный опыт, который проводят через все стадии анализа с использованием всех реактивов согласно методике, но без навески продукта.

4.4 Обработка результатов

Массовую долю бенз(а)пирена Л), %, X и Х 2 , мг/кг, вычисляют по формулам:

= (с - ер) ■m l V ■ 100 = (с - ер) ■ т 1 ■ V (2)

3 т 2 ■ т ■ 1000 ■ 1000 т 2 ■ т ’

_ (с - с 0) ■ V ■ т 1 (3)

где с - концентрация бенз(а)пирена, установленная по 4.3.2 или 4.3.3 в растворе (экстракте) анализируемого продукта, полученного по 4.3.1, мкг/см 3 ; с 0 - концентрация бенз(а)пирена в растворе контрольного опыта, полученного по 4.3.1, мкг/см 3 ; V- объем раствора бенз(а)пирена, выделенного из анализируемой пробы продукта, см 3 ;

/«I - масса экстракта, выделенного из анализируемого продукта, г; т 2 - масса экстракта, нанесенного на широкую полосу пластины, г; т - масса навески продукта, г.

Результат округляют до второй значащей цифры.

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое двух параллельных определений с тем же числом значащих цифр.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает |Л) - Х 2 \ <

< 0,01яЖ, где Xi, Х 2 и X- результаты первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое, a d- норматив контроля сходимости, то среднеарифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива контроля сходимости d приведено в таблице 1.

По полученному результату анализа X и значению относительной погрешности д, приведенной в таблице 1, рассчитывают абсолютную погрешность А = 0,(ШД мг/кг или %.

Результат анализа представляют в виде (X ± А), мг/кг или % при Р = 0,95.

4.5 Контроль точности результатов анализа

Внутренний оперативный контроль (ВОК) качества результатов анализа включает контроль сходимости, воспроизводимости и точности результатов анализа.

4.5.1 Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 4.4.

4.5.2 Для проведения внутреннего контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой в разных лабораториях или в одной лаборатории, максимально варьируя условия проведения анализа, т. е. используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов признают удовлетворительной, если \Х^ - Х 2 \ <

< 0,01 DX, где X/, Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднеарифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 1.

ГОСТ Р 51650-2000

Периодичность проведения контроля воспроизводимости - не реже одного раза в две недели.

Таблица 1- Диапазон измерений, значение характеристики относительной погрешности и нормативы оперативного контроля случайной составляющей относительной погрешности (сходимости и воспроизводимости) при доверительной вероятности Р = 0,95

4.5.3 Для проведения контроля точности используют рабочие пробы с известной добавкой бенз(а)пирена. Пробу делят на две равные части, одну из которых анализируют в соответствии с методикой; во вторую - вводят известную добавку бенз(а)пирена и затем также анализируют в соответствии с методикой. Величина добавки должна составлять 50 - 150 % содержания бензапирена в анализируемой пробе.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если \Ху- X- с\ < 0,01 К, где Ху, Xи с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена, соответственно; К- норматив оперативного контроля точности. Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формулам: при проведении внутрилабораторного контроля (Р = 0,90)

К= 0,84 V (А Х]) 2 + (А х) 2 ; (4)

при проведении внешнего контроля (Р = 0,95)

К = V (А^) 2 + (A z) 2 , (5)

где А^ + А х - значения характеристики погрешности, соответствующие массовой концентрации

бенз(а)пирена в пробе с добавкой и в реальной пробе;

Ау, = 0 ,01 Ху и А х = 0,01д х Х, где Ху и X- массовая доля бенз(а)пирена в пробе с добавкой

и в реальной пробе, % или мг/кг.

Значение относительной погрешности д х (8у) приведены в таблице 1.

Контроль точности анализа проводят не реже одного раза в месяц, а также при смене реактивов или после длительного перерыва в работе.

При превышении нормативов оперативного контроля точности проводят повторные анализы. При повторном превышении указанных нормативов анализы приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Результаты ВОК заносят в специальный журнал.

5 Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматических углеводородов, содержащей бенз(а)пирен, очистке полученной фракции от мешающих примесей на колонке с сефадексом и в тонком слое ацетилированной целлюлозы с последующим количественным определением выделенного бенз(а)пирена высокоэффективной жидкостной хроматографией или спектрофлуориметрией при комнатной температуре.

Диапазон определяемых величин массовой доли бенз(а)пирена в анализируемых продуктах при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и метода спектрофлуориметрии при комнатной температуре 0,0001-0,002 мг/кг или 0,1 х 10 -7 - 2,0 х 10 -7 %. Оптимальный диапазон определяемых массовых концентраций бенз(а)пирена в растворе при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии составляет 0,01-0,02 мкг/см 3 , при использовании метода спектрофлуориметрии - 0,02-0,2 мкг/см 3 .

Бензапирен относится к классу полициклических ароматических углеводородов — ПАУ. Это группа органических соединений, в химической структуре которых присутствуют бензольные кольца — группы от трех колец и больше. Химическое определение бензапирена: органическое вещество, содержащее углерод, входящее в группу полициклических углеводородов, с молярной массой 252,31 г/моль.

Что такое бензапирен

Бензапирен, как и все ПАУ — главным образом результат технического прогресса, следствие деятельности человека. Основные источники техногенного загрязнения ПАУ — сжигание твердых и жидких органических веществ, в том числе нефти и нефтепродуктов, древесины, антропогенных отходов. Из природных источников бензапирена стоит отметить лесные пожары, извержение вулканов.

Однако образование бензапирена может происходить и без процессов горения — при пиролизе, тлении, полимеризации.

Бензапирен выделяется при курении: содержание бензапирена в дыме одной сигареты в среднем составляет 0,025 мкг, что во много раз превышает ПДК (в среднем в 10 000 -15 000 раз). Было подсчитано, что выкуривание одной сигареты по содержанию бензапирена равнозначно шестнадцати часам вдыхания выхлопных газов.

Формула бензапирена

Существует два изомера бензапирена. Первый — 1,2-Бензапирен (3,4-бензпирен) — , содержащийся во всех продуктах горения — нефти, смоле, угле, дыме различного происхождения, в том числе . В чистом виде это игловидные кристаллы или пластинки светло-желтого цвета, с температурой плавления около 177 °С.

4,5-Бензопирен — кристаллы в виде игл и пластинок светло-желтого цвета, с температурой плавления 179°С. Содержится в каменноугольной смоле, обнаруживается в почвах (особенно вблизи предприятий и автомобильных дорог). Мутагенным, канцерогенным свойствами не обладает.

Химическая формула бензапиренов — C20H12.

Бензапирен в почве и воздухе

Бензапирен практически не встречается в свободном состоянии, а всегда осаждается на частицах, содержащихся в воздухе. Вместе с передвигающимися массами воздуха бензапирен разносится по большой площади, а выпадая вместе с твердыми частицами из воздуха (например, при осадках) попадает в почвенные слои, водоемы, на поверхности строений.

В миграции и накоплении бензапирена играет роль и такой его источник, как автомобильный транспорт. С одной стороны, передвигаясь на большие расстояния, автомобили способствуют равномерному разносу бензапирена. С другой стороны, осевший бензапирен в больших количествах скапливается вдоль автомобильных дорог и на объектах рядом с ними (так называемые «вторичные источники»).

Бензапирен легко «включается» в круговорот веществ в природе: с атмосферными осадками, всегда содержащими твердые частички, он заносится даже на территории, удаленные от основного источника ПАУ, попадает в водоемы, откуда, при процессах испарения, вновь поднимается в воздух. Именно такая способность бензапирена мигрировать приводит к тому, что его содержание может быть высоким в местах, где нет мощного источника этого вещества.

Попадая в окружающую среду и накапливаясь в ней, бензапирен проникает в растения, которые в дальнейшем служат кормом для скота или используются в питании человека. Концентрация бензапирена в растениях выше, чем его содержание в почве, а в продуктах питания (или кормах) выше, чем в исходном сырье для их изготовления. Этот эффект наращивания концентрации химических веществ, в том числе бензапирена, получил название биоаккумуляции.

Таким образом, бензапирен представляет опасность не только как фоновое загрязнение окружающей среды, но и как вещество, проникающее в организм по пищевой цепочке.

ПДК бензапирена

Основной метод определения и контроля бензапирена — метод жидкостной хроматографии.

Согласно Гигиеническим нормативам 2.1.6.695-98 и 2.1.6.1338-03 предельно допустимое среднесуточное количество бензапирена в воздухе (ПДКсс) — 0,1 мкг/100 м3 или 10-9 г/м3, а ПДК его в почве по Гигиеническим нормативам 2.1.7.2041-06 — 0.02 мг/кг в сумме с учетом фонового уровня. В воздухе на рабочих местах среднесменная ПДК не более 0,00015 мг / куб.м. (из п.1. и п.2. ГН 2.2.5. 1313-03).

ПДК бензапирена в воде не более 0,000001 мг/л, в питьевой воде при централизованной системе водоснабжения — не более 0,000005 мг/л. В бутилированной питьевой воде — от не более 0,001 мкг/л (вода высшего качества) до не более 0,005 мкг/л в бутилированной воде первой категории качества.

В продуктах питания, в которых допустимо наличие бензапирена из-за технологических особенностей, допустимый уровень бензапирена не более 0,001 мг/кг. К ним относятся: колбасные изделия и изделия с использованием субпродуктов, в том числе копченые; сало копченое; колбасные изделия и копчености из мяса и субпродуктов птицы; копченый консервы и пресервы из рыбы, рыба копченая; зерно продовольственное.

При использовании коптильных ароматизаторов содержание бензапирена не более 2 мкг/кг(л), а после их использования содержание бензапирена в готовых продуктах не должно быть выше 0,03 мкг/кг(л).

В других продуктах питания наличие бензапирена не допускается.

Однако по результатам мониторинга, нормы содержания бензапирена превышены во много раз. В среднем, уровень загрязнения воздуха в городах выше ПДК в 5—12 раз, в почвах — в 3-7 раз, в продуктах питания — от 1,5 до 11 раз.

Влияние бензапирена на организм человека

Бензапирен отнесен к веществам первого класса опасности. Первый класс опасности — это вещества с чрезвычайно высоким опасным воздействием на окружающую среду, при этом изменения, вызываемые ими, необратимы и восстановлению не подлежат.

Бензапирен — один из самых мощных и при этом широко распространенный канцероген. Будучи химически и термически устойчивым, обладая свойствами биоаккумуляции, он, попав и накапливаясь в организме, действует постоянно и мощно. Помимо канцерогенного, бензапирен оказывает мутагенное, эмбриотоксическое, гематотоксическое действие.

Пути проникновения бензапирена в организм разнообразны: с пищей и водой, через кожу и путем вдыхания. Степень опасности находится вне зависимости от того, каким путем произошло попадание бензапирена в организм. В экспериментах, а также по данным мониторинга экологически неблагоприятных районов, бензапирен внедряется в комплекс ДНК, вызывая необратимые мутации, которые переходят в последующие поколения. Особую тревожность вызывает факт биоаккумуляции бензапирена: вероятность развития мутаций у ближайших поколений потомства возрастает из-за биоаккумуляции во много раз.

ХОТИТЕ БРОСИТЬ КУРИТЬ?

Тогда вам к нам на марафон по отказу от сигарет.
С его помощью бросить будет гораздо проще.

4.1.2. Методика выполнения измерений массовой доли бенз(а)пирена в продовольственном сырье, пищевых продуктах и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Назначение и область применения

Методика предназначена для количественного определения бенз(а)пирена (БП) в продовольственном сырье, пищевых продуктах и почве при его массовой доле, указанной в табл. 1. Нижняя граница диапазона измерений соответствует 1/2 допустимого уровня (содержания) токсина в продуктах и сырье, верхняя граница - пятикратному превышению допустимого уровня.

Бенз(а)пирен - высокотоксичное канцерогенное соединение, и его допустимое содержание в пищевых продуктах и продовольственном сырье устанавливается Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.3.2.560-96.

Методика может быть применена учреждениями Госсанэпиднадзора РФ, лабораториями других организаций и предприятий, связанными с исследованиями, химическим анализом и сертификацией продуктов питания. Методика не является арбитражной.

Рис. 11.14.

• 1. Нафталин 9. Хризен (0,17*)
• 2. Аценафтен (1,40*) 10. Бенз(а)пирен
• 3. Флуорен (2,60*) 11. Бенз(Ь)флуорантен (0,26*)
• 4. Фенантрен *2,40*) 12. Бенз(к)флуорантен (0,10*)
• 5. Антрацен (0,13*) 13. Бенз(а)пирен (0,2*)
• 6. Флуорантен (0,74*) 14. Дибенз(а,Ь)антрацен
• 7. Пирен (0,67*) 15. BeH3(g,h,i)nepHaen (0,21*)
• 8. Бенз(а)антрацен (0,07*) 16. Индено(1,2,3-сс1)пирен (0,26*)

Условия анализа:

Колонка: Supelcosil® LC РАН (250 мм х 2,1 мм; 5 мкм);

Градиент: Ацетонитрил (А) 50-100%, вода (В) 50-0%; 200 мкл/мин Температура: 25 °С Объем пробы: 10 мкл Детектирование: СФлу, по программе

Характеристики погрешности измерений

Границы относительной погрешности (±5) результата измерения массовой доли БП (при доверительной вероятности 0,95) указаны в табл. 1.

Таблица 1. Анализируемые объекты, диапазоны и характеристики измерений

Группа продуктов (анализируемый объект)	Допустимое содержание (IV X), мг/кг	Диапазон измерений массовой доли БП, мг/кг	Коэффициент извлечения,	Границы относительной погрешности (±8), %
Копченые мясные, рыбные и жировые продукты

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

Средства измерений

Хроматографы жидкостные:

• - Микроколоночный «Милихром-5», ТУ 25-7405.0009-89, исполнение 3 с флуориметрическим (ФлД) детектором (Вариант 1).
• - Изократический или градиентный жидкостный хроматограф, например «Кпаиег» (Германия), Госреестр средств измерений РФ 16848-97 или Приставка хроматографическая «ВЭЖХ-3», ТОО «Лю- мэкс» (С.-Петербург), снабженные ФлД «Флюорат-02-2М», ТОО «Люмэкс», Госреестр средств измерений РФ 14093-99 (Вариант 2).
• - Изократический или градиентный жидкостный хроматограф с ФлД любого типа, например «Кпаиег» (Германия), Госреестр средств измерений РФ 16848-97 (Вариант 3).

Колонки хроматографические «Диасфер-110-С 16», ТУ 4215-001- 05451931-94, ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва), с типоразмерами, соответствующими варианту хроматографической системы:

• - 2 х 80 мм, dp = 5 - 7 мкм (Вариант 1)
• - 2 х 150 мм, dp = 5 - 7 мкм (Вариант 2)
• - 4 х 150 мм, dp = 5 - 7 мкм (Вариант 3)

Программно-аппаратный комплекс «МультиХром-Спектр», ТУ АЖРЦ

3.036.001, ЗАО «Амперсенд» (Москва), либо любое другое программное обеспечение, позволяющее проводить градуировку и количественное определение методом внешнего стандарта.

ГСО 7515-98 состава раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле с массовой концентрацией бенз(а)пирена 100 мкг/см 3 , АОЗТ «Экрос» (С.-Петербург).

ГСО 7064-93 состава раствора бенз(а)пирена в гексане с массовой концентрацией бенз(а)пирена 100 мкг/см 3 , АОЗТ «Экрос» (С.-Петербург).

Весы лабораторные электронные 4 кл. точности модели ВЛЭ 134, ГОСТ 24104-88 илидр.

Микрошприцы вместимостью 100 мкл фирмы Hamilton, модель Microliter #1710 или аналогичные.

Микропипетки 0,5; 0,2; 0,1 мкл; ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные 2-25,2-50, 2-100 и 2-500, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные 2-10-2, 2-100-2, ГОСТ 1770-74.

Пипетки градуированные 1, 2, 5, 10 см 3 , ГОСТ 29227-91.

Реактивы и материалы

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч, ТУ 6-09-14- 2167-84, ректифицированный.

Вода бидистиллированная, ТУ 6-09-2502-77.

Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78, высушенный над Na2 S04 , ректифицированный.

Бензол, х.ч., ГОСТ 5955-75, высушенный над Na2 S04 , ректифицированный.

Сульфат натрия безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Концентрирующие патроны «Диапак»: А-3, П-3, С; ТУ 4215-002- 05451931-94, ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва).

Вспомогательные устройства

Система для фильтрации и дегазации элюентов ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва) или др.

Стеклянные флаконы для градуировочных и анализируемых растворов вместимостью 1,8 и 5,0 см 3 с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками фирмы Supelco, номера по каталогу 2-6951, 2-7037 и

2-7039, или аналогичные.

Микросмеситель ППЭ-3, «Экрос» (С.-Петербург).

Испаритель ротационный ИР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 или др.

Колбы остродонные с пробками вместимостью 25, 10 и 5 см 3 , ГОСТ 25336.

Устройство для отдувки растворов в токе азота, снабженное термоста- тируемым алюминиевым блоком (суховоздушной баней) СП «БиоМарк» (Львов) или др.

Мембранные фильтры с dp = 0,4-0,5 мкм.

Устройство для создания вакуума около 7 мм рт. ст. (водоструйный насос, ГОСТ 25336; водокольцевой вакуумный насос «Бегемот», УВК-РК2/1, ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва).

Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд) или др. с приемниками проб вместимостью не менее 10 см 3 .

Колба Бюхнера, воронка Бунзена вместимостью не менее 500 и 200 см 3 соответственно, ГОСТ 1770.

Воронка делительная вместимостью 100 и 500 см 3 , ГОСТ 25336.

Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50, 100 и 250 см 3 , ГОСТ 25336.

Колбы грушевидные с пробками вместимостью 50 и 100 см 3 , ГОСТ 25336.

Воронка коническая диаметром не менее 10 см, ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная типа «синяя лента».

Вата медицинская нестерильная, х/б.

Метод измерений

Методика включает следующие основные процедуры:

• - первичная экстракция гексаном и переэкстракция в ацетонитрил БП из пробы копченого продукта;
• - первичная экстракция БП смесью ацетонитрил-вода из пробы зерна или почвы;
• - концентрирование и очистка первичного экстракта методом твердофазной экстракции;
• - разбавление подготовленного экстракта пробы смесью ацетонитрил-вода;
• - градуировка хроматографа по растворам с известным значением массовой концентрации БП;
• - анализ раствора подготовленного экстракта пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с регистрацией сигнала флуоресценции;
• - идентификация определяемого БП по параметрам удерживания;
• - вычисление массовой концентрации БП на основе зарегистрированного аналитического сигнала и градуировочной характеристики;
• - вычисление массовой доли БП, исходя из массовой концентрации БП, массы пищевой пробы и объема раствора подготовленного экстракта.

Требования безопасности

При работе с используемыми химическими соединениями необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, ГОСТ 12.1.018-86 и ГОСТ 12.1.004-76, требования пожарной безопасности, ГОСТ 12.1.004-76.

При попадании растворов БП на кожу" или поверхности предметов необходимо обработать их водой с моющим средством, а затем этиловым спиртом. Растворы должны храниться в холодильнике в герметичной упаковке.

При эксплуатации системы для ВЭЖХ и проведении соответствующих измерений необходимо соблюдать правила электробезопасности, ГОСТ

12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации операторов

К работе допускаются лица:

• - имеющие квалификацию инженера-химика или техника-химика;
• - имеющие опыт работы в химической лаборатории;
• - прошедшие соответствующие курсы обучения и стажировку в лабораториях, аккредитованных на выполнение анализов с применением ВЭЖХ;
• - получившие положительные результаты при выполнении контрольных операций.

Условия выполнения измерений

Подготовку проб, приготовление растворов, подготовку и выполнение измерений проводят при температуре окружающего воздуха 18-25 °С, атмосферном давлении 84,0-100,7 кПа (630-800 мм рт. ст.), влажности воздуха не более 80% (при температуре 25 °С).

При измерениях в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия: напряжение в сети 220±10 В, частота тока в сети 50zh 1 Гц. Измерения проводят в условиях, рекомендуемых описанием и инструкцией по эксплуатации прибора.

Подготовка к выполнению измерений

Стеклянная посуда

Использованную стеклянную посуду перед дальнейшим употреблением ополаскивают последним из применявшихся растворителей и тщательно моют горячей водой с любым моющим порошком, ополаскивают последовательно дистиллированной и бидистиллированной водой и сушат. Чистую посуду хранят, закрыв пробкой или ватным тампоном.

Отбор проб, хранение и обращение с ними

Отбор и усреднение проб проводят в соответствии с нормативными документами на каждый вид продукции (ГОСТ 13586.3-83, ГОСТ 27668-88, ГОСТ 9792-73, ГОСТ 7631-85). Определяемый БП извлекают из проб копченых продуктов экстракцией сухим гексаном, после упаривания которого проводят его переэкстракцию в ацетонитрил. При извлечении БП из проб зерна или почвы используют смесь вода-ацетонитрил (16:84). Последующие концентрирование и очистку первичного экстракта пробы, содержащего БП, вне зависимости от характера исходного продукта выполняют в соответствии с комплексной схемой твердофазной экстракции с использованием трех концентрирующих патронов Диапак А-3, П-3, С.

Подготовленные пробы (экстракты проб) растворяют в смеси ацетонитрил-вода (70:30).

Каждое измерение массовой доли БП включает подготовку и хроматографический анализ не менее двух проб.

Приготовление смесей растворителей

Смеси растворителей готовят объемным методом в мерных цилиндрах. Требуемые объемы ацетонитрила и воды отмеряют отдельными мерными цилиндрами, а затем смешивают. Экстрагент А: смесь ацетонитрил-вода (84:16).

Приготовление экстрагентов

Для приготовления взаимнонасыщенных ацетонитрила и гексана в делительной воронке вместимостью 500 см 3 встряхивают около 300 см 3 ацетонитрила и 100 см 3 гексана. После расслоения растворителей раздельно отбирают слои: нижний (ацетонитрил, насыщенный гексаном, - экстрагент Б) и верхний (гексан, насыщенный ацетонитрилом, - экстрагент В), интерфазу отбрасывают.

Приготовление элюентов

Для проведения измерений методом ВЭЖХ готовят смеси ацетонитрил-вода в следующих соотношениях: (90:10) - элюент 90, (84:16) - элю- ент 84, (80:20) - элюент 80, (70:30) - элюент 70. Готовые элюенты фильтруют через мембранный фильтр и проводят вакуумную или термическую дегазацию.

Приготовление градуировочных растворов

ГСО состава раствора БП в ацетонитриле (см. выше) перед использованием разбавляют смесью ацетонитрил-вода (7:3). Пипеткой отбирают

1,0 см 3 исходного раствора, помешают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и добавляют растворитель до метки. Далее пипеткой отбирают определенные объемы полученного раствора, помешают их в мерную колбу вместимостью 10 см 3 и добавляют растворитель до метки. Соответствующие объемы растворов, используемых для разбавления, и концентрации градуировочных растворов 2-5 (Вариант 1) и 3-7 (Варианты 2, 3) указаны в табл. 2. При использовании ГСО состава раствора БП в гексане (см. ниже) после упаривания растворителя в условиях, приведенных ниже, сухой остаток перерастворяют в ацетонитриле и разбавляют, как описано выше, с учетом значения аттестованной концентрации ГСО.

Таблица 2. Растворы для градуировки при анализе бензопирена (БП)

Массовая концентрация БП (аттестованное значение ГСО), мкг/см 3	Исходный раствор для разбавления		Градуировочный
				Массовая концентрация БП, мкг/см 3

*Не используется для непосредственной градуировки хроматографической системы.

Подготовка хроматографической системы

Хроматограф включают и подготавливают к работе в соответствии с его описанием и руководством к эксплуатации. Устанавливают колонку «Диасфер-110-С 16» с типоразмерами в соответствии с вариантом хроматографа (см. выше). Прокачивают через хроматографическую систему элюент с наибольшей концентрацией ацетонитрила до стабилизации базовой линии детектора, а затем кондиционируют ее в начальных условиях градиента по соответствующим разделам «Условия проведения анализа».

Подготовка концентрирующих патронов

Концентрирующие патроны Диапак А-3 и П-3 подготавливают к работе следующим образом:

• 1. В полипропиленовый корпус объемом 10 см 3 со сменным фильтром в нижней части засыпают 3 см 3 сухого сорбента Диапак А или П. Верхнюю пустую часть корпуса используют в качестве воронки для нанесения пробы или элюента.
• 2. Закрепляют патрон вертикально в подходящем устройстве для вакуумирования и формируют постукиванием ровный горизонтальный верхний слой сорбента. Для окончательной подготовки патрона Диапак А-3 достаточно зафиксировать слой сорбента небольшим ватным тампоном.
• 3. Для подготовки патрона Диапак П-3 сорбент промывают последовательно 10 см 3 бензола, ацетона и экстрагента А при слабом вакуумировании (скорость скапывания не более 1-2 капель в секунду), не допуская попадания воздуха на сорбент. После заполнения патрона ацетоном дают сорбенту отстояться, вводят верхний полимерный фильтр, уплотняют его по верхнему слою сорбента и продолжают промывку. При достижении экстрагентом А уровня 2-3 см над фильтром промывку прекращают и патрон укупоривают нижней заглушкой и верхней крышкой (для хранения). При случайном пересыхании патрон промывают экстрагентом А. Перед нанесением пробы заглушки снимают и при слабом вакуумировании пропускают остатки водно-ацетонитрильной смеси до уровня верхнего фильтра, затем немедленно заливают исследуемый раствор. Регенерацию многоразового патрона Диапак П-3 проводят по аналогичной схеме, исключая извлечение верхнего фильтра.

Концентрирующий патрон Диапак С подготавливают к работе следующим образом:

• 1. Готовая полипропиленовая капсула с 1 см 3 сорбента Диапак С укупорена заглушками. После снятия заглушек патрон подготавливают к работе, пропуская через него при помощи шприца 5 см 3 гексана при скорости скапывания 1-2 капли в секунду.
• 2. Пробу наносят самотеком, используя в качестве воронки пустой полипропиленовый корпус объемом 10 см 3 , плотно закрепленный в верхнем штуцере капсулы Диапака С.

Подготовка пробы к измерениям

Экстракция гексаном бенз(а)пирена из пробы копченого продукта Навеску 10,0 г пробы копченого продукта растирают в ступке с 30 г безводного сульфата натрия. Смесь количественно переносят в плоскодонную колбу вместимостью 100 см 3 и экстрагируют гексаном в объеме 40 см 3 в течение не менее 30 мин при перемешивании. Первичный гексановый экстракт суммарного жира пробы декантируют и пропускают через 10 г безводного сульфата натрия в отгонную колбу. Дважды повторяют процедуру экстракции двумя объемами по 20 см 3 гексана и пропускают порции экстракта через осушитель в ту же отгонную колбу. Упаривают гексан на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °С до исчезновения запаха.

Экстракт суммарного жира растворяют в 20 см 3 экстрагента В, количественно переносят в мерный цилиндр вместимостью 50 см 3 и доводят объем раствора до 40,0 см 3 тем же растворителем.

20,0 см 3 полученного раствора переносят в делительную воронку вместимостью 100 см 3 и проводят переэкстракцию БП в ацетонитрил тремя объемами по 20 см 3 экстрагента Б. Каждый раз, добиваясь по возможности более полного разделения фаз, отбирают нижний слой (ацетонитрильный экстракт БП) и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С до объема 10-15 см 3 . Количественно (при помощи ацетонитрила) переносят раствор в мерный цилиндр вместимостью 25 см 3 , доводят объем до 21,0 см 3 ацетонитрилом, добавляют 4,0 см 3 бидистиллированной воды и тщательно перемешивают полученный водно-ацетонитрильный экстракт БП.

Экстракция бенз(а)пирена из пробы зерна или почвы смесью ацетонитрил-вода

Навеску 10-25 г пробы переносят в плоскодонную колбу, добавляют 50-125 см 3 экстрагента А, строго соблюдая соотношение 1:5 навески продукта к объему экстрагента, и перемешивают в течение 1 часа. Фильтруют водно-ацетонитрильный экстракт БП через бумажный фильтр на воронке Бюхнера под вакуумом и отжимают осадок на фильтре.

Предварительная очистка и концентрирование первичного экстракта зерна или копченого продукта

Пропускают через патрон Диапак А-3 25,0 см 3 а затем 3 см 3 экстрагента А при скорости скапывания 2-3 капли в секунду в приемную колбу.

Пропускают через подготовленный патрон Диапак П-3 собранный элюат, а затем 5 см 3 ацетонитрила при скорости скапывания 1-2 капли в секунду, отбрасывая смывы. Элюируют с патрона целевую фракцию, содержащую БП, смесью бензол-ацетонитрил (1:1) в объеме 7 см 3 при скорости скапывания 1-2 капли в секунду в отгонную колбу. Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С, добавляют в колбу 0,5 см 3 гексана и тщательно встряхивают на микросмесителе до полного растворения сухого остатка.

Предварительная очистка и концентрирование первичного экстракта почвы

Пропускают через патрон Диапак А-3 5,0 см 3 водно-ацетонитрильного экстракта БП, затем 3 см 3 экстрагента А при скорости скапывания 2-3 капли в секунду в приемную колбу. Переносят элюат в мерный цилиндр вместимостью 25 см 3 , ополаскивают колбу двумя объемами по 5 см 3 экстрагента А и доводят объем раствора в цилиндре до 20 см 3 .

Пропускают через подготовленный патрон Диапак П-3 5,0 см 3 разбавленного элюата, а затем 5 см 3 ацетонитрила при скорости скапывания 1-2 капли в секунду, отбрасывая смывы. Элюируют с патрона целевую фракцию, содержащую БП, смесью бензол-ацетонитрил (1:1) в объеме 7 см 3 при скорости скапывания 1-2 капли в секунду в отгонную колбу. Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С, добавляют в колбу 0,5 см 3 гексана и тщательно встряхивают на микросмесителе до полного растворения сухого остатка.

Тонкая очистка экстракта

Наносят на подготовленный патрон Диапак С самотеком 0,5 см 3 раствора пробы в гексане, затем обмывают колбу двумя порциями по 0,5 см 3 гексана и последовательно наносят их на патрон, отбрасывая все смывы. Элюируют БП бензолом в объеме 2,0 см 3 со скоростью скапывания 1-2 капли в секунду в отгонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С. Растворяют сухой остаток экстракта пробы БП в смеси ацетонитрил-вода (7:3), объемы которой указаны в разделах «Условия проведения измерения» для каждого варианта хроматографической системы (см. ниже).

Градуировка и выполнение измерений

Градуировка хроматографа

Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом (в условиях проведения измерения БП) номинального объема градуировочных растворов (табл. 2) в порядке возрастания их массовых концентраций. Каждый раствор вводят в хроматограф не менее двух раз. При правильной настройке хроматографической системы высота пика на хроматограмме градуировочного раствора с наименьшей концентрацией должна превышать уровень шумов базовой линии не менее чем в 10 раз.

После математической обработки хроматограмм фиксируют параметры удерживания и площади пиков и строят градуировочные характеристики (ГХ), отражающие зависимость среднего значения площади пика от массовой концентрации БП в градуировочном растворе .

Контролируют правильность построения градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику перестраивают при смене колонок, после проведения ремонтно-профилактических работ, при отрицательных результатах контроля стабильности ГХ (см. ниже).

Определение бенз(а)пирена

Условия проведения измерения (Вариант 1)

Для анализа подготовленный экстракт пробы БП растворяют в 0,1 см 3 смеси ацетонитрил-вода.

Режимы работы ФМД и УВПА задают с клавиатуры ЭВМ в соответствии с Руководством пользователя (ПАК «МультиХром-Спектр») и контролируют на мониторах в следующем виде:

Флуориметрический детектор

• длина волны возбуждения 296 нм;
• длина волны испускания - светофильтр № 2 (более 380 нм);
• время измерения 0,2 с.

Автоматический дозатор

• объем регенерации 0,4 см 3 ;
• объем пробы 0,04 см 3 ;
• скорость потока 0,15 см 3 /мин;
• скорость набора 0,3 см 3 /мин;
• время удерживания БП 11 мин.
• состав элюентов в сосудах и схема составления градиента ацетонитрила представлена в табл. 3.

Таблица 3. Элюенты

Условия проведения измерении (Вариант 2)

Для анализа подготовленный (см. выше) экстракт пробы БП растворяют в 0,5 см 3 смеси ацетонитрил-вода.

• фильтр на линии возбуждения - «Х4»;
• фильтр на линии эмиссии - «ХЗ»;
• объем пробы 0,02 см 3 ;
• чувствительность средняя;
• сглаживание - 4;
• уровень «фона» выбирают по результатам регистрации пробной хроматограммы градуировочного раствора № 3.

• скорость потока 0,2 см 3 /мин;
• элюент 84;
• время удерживания БП около 12 мин.

Градиентный режим разделения:

• скорость потока 0,25 см 3 /мин;
• элюента 100в элюенте 70 за 20 мин;

Условия проведения измерении (Вариант 3)

Для анализа подготовленный экстракт пробы БП растворяют в 0,5 см 3 смеси ацетонитрил-вода.

• длина волны возбуждения 375 нм;
• длина волны эмиссии 405 нм;
• скорость потока 0,8 см 3 /мин;
• объем пробы 0,02 см 3 ;
• постоянная времени 1,0 с.

Изократический режим разделения:

• элюент 84;
• время удерживания БП около 12 мин;

Градиентный режим разделения:

• линейный градиент от 30 до 70% элюента 100в элюенте 70 за 20 мин;
• время удерживания БП около 14 мин.

Получение и обработка хроматограмм

Ввод в хроматограф раствора экстракта пробы осуществляют два раза. Идентификацию БП проводят на основании сравнения параметров удерживания пиков на хроматограммах экстракта пробы и градуировочных растворов. Ориентировочные параметры удерживания указаны в разделах «Условия проведения измерений». Надежной идентификации определяемого соединения соответствует разность значений параметров удерживания для градуировочного раствора и пробы, не превышающая 0,2 мин.

Разбавление раствора экстракта

Проводят в том случае, если массовая концентрация определяемого БП превышает его наибольшую массовую концентрацию в градуировочных растворах. Раствор экстракта разбавляют вдвое (степень разбавления, dil = 2), отбирая равные объемы данного раствора и смеси ацетонитрил-вода (70:30) и смешивая последние. В том случае, если однократное разбавление не избавляет от «зашкаливания», процедуру повторяют (степень разбавления, dil = 4).

Обработка результатов измерений

Вычисляют среднее значение площади пика (выходного сигнала хроматографа) для двух вводов раствора экстракта пробы в хроматограф. Контролируют сходимость выходных сигналов (см. ниже).

По градуировочной зависимости находят значение массовой концентрации БП в растворе, соответствующее среднему значению площади пика.

Массовую долю БП (И^), мг/кг, в /-ой пробе (результат определения) вычисляют по формуле

где Сбп - массовая концентрация определяемого вещества в растворе экстракта /-ой пробы БП, мкг/см 3 (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из среднего значения площади пика); V p - объем раствора экстракта /-ой пробы БП, см 3 ; R - степень извлечения БП на стадии пробо- подготовки по табл. 2; М экв - масса части пробы, соответствующая доле водно-ацетонитрильного экстракта БП, использованной для очистки и последующего хроматографического определения - эквивалентная масса пробы, составляющая 5,0 г (зерно, копченые продукты) или 0,25 г (почва).

В случае разбавления экстракта (см. выше) массовую долю БП (W,-, мг/кг) в /-ом измерении вычисляют по формуле

где Wj - значение, полученное по формуле (II. 1), dil - степень разбавления (см. выше).

Вычисляют среднее для двух проб значение массовой доли БП (результат анализа):

Контролируют сходимость результатов определений массовой доли БП (см. ниже).

Оформление результатов измерений

Результат анализа (измерения) массовой доли БП в определяемом объекте представляют в форме

где W - массовая доля БП, рассчитанная по формуле (II.3).

В случае, если БП не обнаружен, результат измерения представляют в форме

где П"дс - допустимое содержание БП по табл. 1.

Контроль погрешности МВИ

Контроль сходимости выходных сигналов хроматографа

Контроль проводят при градуировке и анализе каждой пробы в отношении выходных сигналов (значений площадей пиков БП на хроматограммах), полученных при двух вводах раствора в хроматограф. Результат контроля признают удовлетворительным, если размах выходных сигналов, отнесенный к среднему арифметическому, не превышает 8%.

Контроль правильности построения градуировочной характеристики

Контроль проводят при каждой градуировке. Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении для каждогоу"-го градуировочного раствора условия

где Sj - среднее значение площади пика БП дляу"-го градуировочного раствора, у.е.; S) - значение площади пика, соответствующее по градуировочной характеристике массовой концентрации БП в у"-ом градуировочном растворе, у.е.

Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль проводят ежедневно перед началом работы с анализируемыми пробами по контрольному раствору, в качестве которого используют градуировочный раствор с массовой концентрацией БП, соответствующей его допустимому содержанию в анализируемом объекте.

Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении условия

где С ки - значение массовой концентрации БП в контрольном растворе, найденное по градуировочной характеристике для среднего значения площади пика, мкг/см 3 ; С к - значение массовой концентрации БП в контрольном растворе согласно табл. 2.

Контроль сходимости результатов определения

Контроль проводят при каждом анализе (измерении). Результат контроля признают удовлетворительным, если размах результатов определений, отнесенный к среднему арифметическому (результату анализа), не превышает 10%.

Контроль погрешности методом добавок

Контроль проводят:

• а) перед началом применения настоящей МВИ - в обязательном порядке;
• б) при появлении сомнительных результатов определения массовой доли БП;
• в) в соответствии с планами внутрилабораторного контроля;
• г) по требованию организаций, контролирующих деятельность лаборатории.

Добавка формируется на основе градуировочного раствора. Величина добавки (D, мг/кг) выбирается такой, чтобы массовая доля БП в пробе увеличилась в 1,5-2,5 раза. Расчет проводят по формуле

где C D - массовая концентрация БП в градуировочном растворе, мкг/см 3 ; Vo - объем градуировочного раствора БП, вводимого в пробу, см 3 ; М жв - эквивалентная масса пробы, взятой на анализ, г.

Добавка вводится в первичный экстракт пробы зерна или почвы в виде градуировочного раствора, приготовленного в соответствии с табл. 2. В первичный экстракт копченого продукта добавка вводится в виде раствора аналогичной концентрации в гексане. Для этого ГСО состава БП в гексане (см. выше) разбавляют (с учетом поправки на аттестованное значение концентрации) в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. выше), используя в качестве растворителя гексан и получая раствор требуемой концентрации. При использовании ГСО состава БП в ацетонитриле после упаривания растворителя сухой остаток перерастворяют в гексане и разбавляют гексаном, как описано выше.

Анализ двух проб с естественным содержанием БП и двух проб с добавкой БП проводят в одинаковых условиях (один прибор, одна градуировочная характеристика, один оператор). Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении условия

где W D - массовая доля БП в пробах с добавкой, мг/кг; W - массовая доля БП в пробах без добавки, мг/кг (W D и W- средние значения массовой доли для двух проб при положительных результатах контроля сходимости).

Иллюстрацией применения этой методики в практической экоаналитике могут служить хроматограмма и градуировочный график для определения бенз(а)пирена в пищевых продуктах (рис. 11.15 и 11.16).

Результаты контроля погрешности определения бенз(а)пирена в объектах методом добавок с флуориметрическим детектированием 375 Ех/405 Ет (Вариант 3).

Уровень добавки соответствует 0,5 допустимого содержания бензапирена (0,0005 мг/кг - зерно и копченые продукты, 0,01 мг/кг - почва).

Рис. 11.15.

Градуировка для компонента: БаП Коэффициент корреляции: 0,999667 Отклик: Площадь

Опорный канал 365 Ех/405 Em

Формула Y = Ki X

Значения 100 (W D - W - D)/D составляют 10 и 16% для образцов 1 и 2 соответственно. Определяемое соединение в исходном образце пшеничной муки присутствует в количестве 0,00009 кг/кг.

Образец 1 - 0,00064 мг/кг Образец 2 - 0,00067 мг/кг

• В общем случае градуировочная характеристика имеет виды S = АС + В, где S - площадь пика, у.е.; С - массовая концентрация загрязнителя, мкг/см3; А и В - коэффициенты.